Ligand-induced N-terminal proteolysis of the human endothelin B receptor

Abstract

The human endothelin B (ETB) receptor comprises 442 amino acids, of which the first 26 function as a signal peptide. The signal peptide, which is essential for cell surface transport is cleaved off by a signal peptidase in the ER lumen during receptor biosynthesis. In addition, a second protheolytic cleavage within the extracellular N terminus (at R64/S65) has been identified, which results in an N-terminally truncated receptor, lacking amino acids 26 to 64. The regulation and the physiological significance of this proteolysis were not known when this study was started. To gain more insight into the process of N-terminal proteolysis, ETB receptor or ETB·GFP fusion protein stably or transiently expressed in human embryonic kidney 293 (HEK 293) cells and in vascular smooth muscle cells (VSMCs) were analyzed. After incubation of cells with 125I-ET-1 at 4°C, only the full-length ETB receptor was detected at the cell surface. When cells were incubated at 37°C in the presence of endothelin-1, N-terminal cleavage was observed. The cleavage was not prevented by inhibitors of internalization (sucrose, phenylarsine oxide) or of serine and cysteinyl proteases. However, when cells were incubated with internalization and metalloprotease inhibitors (batimastat, inhibitor of TNFa- converting enzyme Ro32-7315) or metal chelators (EDTA, phenanthroline), the cleavage was blocked. The data show that metalloproteases mediate an agonist- dependent cleavage of the ETB receptor at the cell surface. Functional analysis of a mutant ETB receptor lacking the first 64 amino acids (D2-64 ETB) revealed normal ligand binding properties and preserved G protein-signaling (increase of inositol phosphate formation and inhibition of forskolin-induced cAMP-formation) when compared to the wild-type receptor. However, the D2-64 ETB receptor showed a 15-fold reduced cell surface expression and an altered ability to activate ERK1/2. Although the wild-type and the D2-64 ETB receptor elevated an early phase of ERK1/2 phosphorylation (within 5 min), only the wild-type receptor induced a second phase of ERK1/2 activation (starting after 80 min). The second phase was mediated via bg subunit of Gi proteins and was abolished by inhibitors of matrix metalloproteases (batimastat and an inhibitor of TNFa-converting enzyme Ro32-7315). The data presented in this study strongly suggest, that the N-terminal proteolysis of the human ETB receptor is mediated by a metalloprotease in an agonist-dependent manner. Removal of the ETB receptor s N terminus yields a receptor with a dramatically reduced cell surface expression and an altered ability to stimulate ERK1/2 activation. The data suggest, that the N-terminal cleavage of the ETB receptor could be involved in the regulation of cell surface expression and of ERK1/2 activation. The functional role of the observed biphasic ERK1/2 activation via the full-length ETB receptor and the monophasic ERK1/2 activation via the D2-64 ETB receptor requires further characterization.

Der humane ETB-Rezeptor gehört zur Gruppe der Rhodospin-ähnlichen G-Protein- gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Im Gegensatz zu den meisten anderen Vertretern der Rhodopsin-ähnlichen GPCR, verfügt der ETB-Rezeptor über ein abspaltbares Signalpeptid, das für die Ausbildung der korrekten Topologie in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) und den Transport zur Plasmamembran essentiell ist. Neben der Abspaltung des Signalpeptids im Lumen des ER erfolgt eine weitere Proteolyse des extrazellulären N-Terminus des ETB-Rezeptor zwischen Arginin 64 und Serin 65. Die N-terminale Proteolyse des ETB-Rezeptors konnte in allen bisher untersuchten Spezies nachgewiesen werden (Rind, Schwein, Mensch, Ratte, Maus). Allerdings sind die Regulation und die physiologische Bedeutung dieser Proteolyse bislang nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war, die genauen Mechanismen und die funktionellen Konsequenzen der N-terminalen Proteolyse aufzuklären. Es wurde festgestellt, dass die N-terminale Proteolyse des ETB-Rezeptors durch eine Metalloprotease in einem Agonist-abhängigen Prozess vermittelt wird. Damit kommen als Kandidaten für die N-terminale Proteolyse in erster Linie die Membran-assoziierten Metalloproteasen (MT-MMPs) sowie Proteasen der ADAM-Familie in Frage. Der Nachweis von intakten oder N-terminal gespaltenen ETB-Rezeptoren erfolgte mittels Low-Temperature- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (LT-PAGE). Nach Markierung der Oberflächenrezeptoren mit 125I-ET-1 (30 Min, 4°C) wurden die Zellen lysiert und mit einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei 4°C aufgetrennt. Die gebildeten 125I-ET-1/ETB-Rezeptorkomplexe bleiben unter diesen Bedingungen stabil und können anschließend in einer Autoradiographie dargestellt werden. Die funktionelle Charakterisierung von HEK293 Zellen, die entweder den wildtypischen ETB-Rezeptor oder einen gentechnisch modifizierten ETB-Rezeptor (D2-64 ETB-Rezeptor) exprimierten, dem die ersten 64 Aminosäuren fehlen, zeigten keine Unterschiede in der Affinität für ET-1 und der ET-1-vermittelten Hemmung der Forskolin-induzierten cAMP-Bildung. Jedoch unterschieden sich der wildtypische Rezeptor und der N-terminal verkürzte ETB- Rezeptor ihrer Fähigkeit Extrazellulär Signal-regulierte Kinasen (ERK1 und ERK2) zu aktivieren. So wiesen Gefäßmuskelzellen oder HEK293 Zellen, die den wildtypischen ETB-Rezeptor exprimierten, in Gegenwart von ET-1 oder dem selektiven ETB-Rezeptoragonisten IRL1620 eine biphasische, lang-anhaltende ERK1/2-Aktivierung auf. Die erste Phase hielt für etwa 30 Minuten an, auf die nach weiteren 50 Minuten eine zweite Phase folgte. Hingegen wiesen Gefäßmuskelzellen oder HEK293 Zellen, die den D2-64 ETB-Rezeptor exprimierten, lediglich die erste Phase der ERK1/2 Aktivierung auf. In weitere Analysen konnte gezeigt werden, dass diese zweite Phase durch einen Pertussistoxin- sensitiven Gi-vermittelten Signalweg vermittelt wird.