Axonales Auswachsen in der Hippocampusformation während der Entwicklung und nach Läsion

Abstract

Während der Entwicklung haben die Nervenzellen des Gehirns die bemerkenswerte Fähigkeit, gegenseitige Verbindungen auszubilden, ein Entwicklungsvorgang, der präzises axonales Auswachsen, Wegfindung und korrekte Synapsenbildung voraussetzt. Im Gegensatz dazu, ist die Fähigkeit, neuronale Kontakte nach Läsion wieder herzustellen im ZNS sehr begrenzt. Zunächst untersuchten wir in vitro die späte embryonale und postnatale Entwicklung der hippocampalen Formation mit ihren Projektionen, in für das Homeobox-Gen Emx2-defizienten Mäusen. Da die Emx2-Knockout-Tiere perinatal versterben, haben wir organotypische Schnittkulturen hergestellt. In Schnitten von Knockout-Tieren war die Zytoarchitektur des prospektiven Gyrus dentatus gestört, reiften die Körnerzellen nicht aus und bildeten auch keinen Moosfasertrakt. Diese Befunde zeigen, dass Emx2 essentiell für die endgültige Differenzierung der Körnerzellen und ihrer korrekten Ausbildung der intrinsischen hippocampalen Projektionen ist. Im nächsten Versuchsaufbau konnten wir unter Verwendung der organotypischen Kokultur und anhand von in vivo Experimenten weiterhin in unseren Untersuchungen belegen, dass in den Vorgängen des Auswachsens, der Wegfindung und der synaptischen Zielfindung während der Entwicklung und nach Läsion, die Entität der Polysialinsäure (Polysialic Acid = PSA) involviert ist. Diese stellt eine einzigartige während der Entwicklung regulierte posttranslationale Modifikation des Neuralen Zelladhäsionsmolekül (Neural Cell Adhesion Molecule) NCAM dar. Durch die Verwendung eines chemisch veränderten Sialinsäurevorläufers, konnten wir die Polysialylierung von NCAM zu definierten Entwicklungs- und postläsionalen Zeitpunkten hemmen. Der PSA- Mangel bewirkte nicht nur eine fehlerhafte Moosfaserverteilung in der CA3- Pyramidenzellband, sondern auch das aberrante Eindringen von Moosfasern in die CA1-Region in vivo und förderte das axonalen Auswachsens in vitro. Des Weiteren war die Reinnervation der Moosfasern nach Läsion durch die Inhibition der PSA-Synthese in vitro signifikant erhöht. Basierend auf diesen Ergebnissen schlussfolgern wir, dass PSA notwendig für die axonale Zielfindung während der Ausbildung neuraler Schaltkreise ist und andererseits die Regeneration nach Läsion stört. Dieses Fazit impliziert umgekehrt einen positiven Effekt der pharmakologischen Modifikation von NCAM auf die Regeneration nach axonaler Schädigung, die sich in weiterführenden Experimenten als viel versprechend, in Hinblick auf einen möglichen therapeutischen Nutzen, herausstellen könnte. Um das Phänomen des axonalen Auswachsens besser untersuchen zu können, variierten wir das bereits etablierte Modell der organotypischen Kokultur. In dieser Arbeit nutzten wir die Axonales Auswachsen in der Hippocampusformation 58 organotypische Kokultur mit neugeborener wildtyp und β-Aktin-GFP transgener Maus. Dies erlaubte es uns, die Axone in situ zu markieren und die gesamte Projektion zu verfolgen. In Kokulturen von entorhinalem Cortex und Hippocampus terminierten die GFP-markierten entorhinalen Axone und die kommissuralen Axone in den korrekten hippocampalen Schichten. Ausgehend von diesen Befunden, konnten wir demonstrieren, dass dieser Chimären-Kokultur- Ansatz dazu geeignet ist, die Gesamtheit sich entwickelnder Projektionen darzustellen und die Möglichkeit bietet, direkt das axonale Ansteuern und Auswachsen lebender Neuronen zu beobachten.

During development, nerve cells within the brain have the remarkable ability to form mutual interconnections, a process that relies on precisely orchestrated steps of axonal outgrowth, pathfinding, and correct synaptic targeting. In contrast, reestablishing neuronal circuits after lesion in the CNS is extremely limited. First we analysed the late embryonic and postnatal development of the hippocampal formation and its axonal projections in mice lacking the homeobox gene Emx2 expression in vitro. Since the Emx2 mutants die perinatally we used slice cultures of Emx2 mutant hippocampus to circumvent this problem. In mutant cultured hippocampus the presumptive dentate gyrus failed to develop its normal cytoarchitecture and mature dentate granule cells, including the lack of their mossy fiber projection. These data indicate that Emx2 is essential for the terminal differentiation of granule cells and the correct formation of intrinsic hippocampal connections. In another set-up, using the model of the organotypic slice culture as well as in vivo experiments in our investigations we were able to provide confirmation, that the processes of outgrowth, pathfinding, and synaptic targeting during development and following lesion involve the polysialic acid (PSA) moiety, which is a unique, developmentally regulated posttranslational modification of the neural cell adhesion molecule (NCAM). Using a chemically modified sialic acid precursor, we inhibited NCAM polysialylation at selected developmental and postlesional time points. PSA deficiency resulted not only in an abnormal mossy fiber pattern in the CA3 pyramidal layer but also in aberrant invasion of mossy fibers into the CA1 region in vivo and promotion of axonal outgrowth in vitro. Furthermore, the reinnervation by mossy fibers after lesion was significantly enhanced when inhibiting PSA formation in vitro. Based on our data, we conclude that PSA is necessary for correct axonal targeting during neuronal circuit formation, but inhibits regeneration after lesion. Conversely, these results imply that pharmacological modification of NCAM could be beneficial for regeneration following axonal damage, and further experiments may be promising with regard to a potential therapeutical use of this approach. And finally to better investigate the phenomenon of axonal outgrowth, we modified the wellestablished organotypic slice culture approach. Here we used organotypic slice co-cultures from neonate wild-type mice and ß -actin-gfp transgenic mice, which allowed us to prelabel the vital axons and to monitor the complete axonal projection. In co-cultures from entorhinal cortex and hippocampus, gfp-labeled entorhinal axons and commissural projections terminate in their correct hippocampal layers. From our data, we demonstrate that this chimaeric co-culture Axonales Auswachsen in der Hippocampusformation 60 approach is appropriate in tracing entire developing projections and may serve as a tool in directly observing the navigation and axonal elongation of living neurons.