dc.contributor.author
Thomas, Ulf
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:49:38Z
dc.date.available
2002-11-28T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/11050
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15248
dc.description
0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 6
1.1 Lernen und neuronale Plastizität 6
1.1.1 Nicht-assoziative und assoziative Lernformen 6
1.1.2 Modellsysteme für die Untersuchung von Lern- und Gedächtnisphasen 8
1.1.3 Molekulare Mechanismen von Lernen und Gedächtnis 12
1.2 Protein Kinase C 15
1.2.1 Die PKC-Familie: Einteilung und Aktivatoren 15
1.2.2 Aktivierungsmechanismen der PKC 16
1.2.3 Substrate und Funktionen von neuronaler PKC 17
1.3 Ziel dieser Arbeit 18
2\. Material und Methoden 20
2.1 Methoden 20
2.1.1 Vorbereitung der Versuchstiere 20
2.1.1.1 Habituation und Dishabituation 20
2.1.1.2 Sensitisierung 21
2.1.1.3 Olfaktorische Konditionierung 21
2.1.1.4 Injektion der Pharmaka 21
2.1.2 Immunchemische und immunhistologische Techniken 22
2.1.2.1 Präparation der Pilzkörper 22
2.1.2.2 Immunhistologie 23
2.1.2.3 Proteinquantifizierung mittels ELISA-Technik (Enzyme linked sorbent
assay) 24
2.1.2.4 Westernblot 25
2.1.2.5 Immunpräzipitation 26
2.1.3 Bestimmung der Proteinkinase-Aktivität 27
2.1.4 Diskontinuierliche Gelelektrophorese 29
2.2 Material 30
2.2.1 Puffer und Lösungen 30
2.2.2 Chemikalien 32
2.2.3 Antikörper und Enzyme 33
2.2.4 Verbrauchsmaterialien 34
2.2.5 Geräte 34
3\. Ergebnisse 35
3.1 Etablierung von Methoden zur Messung und Inhibition von PKC- und PKM-
Aktivität 35
3.1.1 Die PKC-Gesamtaktivität kann nicht auf die PKC-Isoformen unterteilt
werden 35
3.1.2 Eine Methode zur Differenzierung von PKC und PKM-Aktivität 37
3.1.3 Bestimmung eines spezifischen PKC-Inhibitors 38
3.1.4 Bestimmung eines PKM-Inhibitors 40
3.2 Inhibition der PKC-Aktivität während nicht assoziativer Lernprozessen 42
3.2.1 Habituation 42
3.2.2 Sensitisierung 42
3.3 Inhibition der PKC-Aktivität während und nach assoziativen Lernprozessen
43
3.3.1 Inhibition der PKC-Aktivität während der olfaktorischen Konditionierung
44
3.3.2 Inhibition der PKC-Aktivität bei der Gedächtnisbildung 45
3.4 Wird die Reduktion im Gedächtnis durch die Inhibition der PKC- oder der
PKM-Aktivität verursacht? 47
3.5 Quantifizierung der PKC nach assoziativem Lernen 48
3.5.1 Eine Stunde nach dem Training wird weniger membrangebundenePKC
detektiert 48
3.5.2 Die Inhibition der PKC-Aktivität verhindert die Reduktion der
membrangebundenen PKC 51
3.5.3 Hinweise auf Komplexbildung durch Aufarbeitung mit Harnstoff und
Trypsin 52
3.6 Direkter Nachweis von PKC-Proteinkomplexen 55
3.7 Nachweis der PKC-Komplexbildung nach der olfaktorischen Konditionierung
58
3.8 Identifikation eines PKC Bindeproteins 60
3.8.1 Charakterisierung eines RACK1-Antikörpers 60
3.8.2 Immunhistologische Untersuchung der RACK1 Verteilung im Bienengehirn
62
3.8.3 RACK1 bindet in den Kenyonzellen der Biene nur an aktive PKC 64
4\. Diskussion 66
4.1 Untersuchungen zur Spezifität von PKC-Inhibitoren 66
4.2 Quantifizierung der PKC mit Hilfe eines Antikörpers 67
4.3 Nicht assoziative Lernen wird durch die Inhibitionder PKC-Aktivität nicht
beeinflusst 68
4.4 PKC ist notwendig für das Langzeitgedächtnis von assoziativen Lernformen
69
4.5 Mechanismen der PKC Modulation bei plastischen Prozessen 72
4.6 PKC Bindeproteine und ihre Funktion 73
4.7 Hinweise für eine Interaktion der PKC mit Ankerproteinen bei der
Gedächtnisbildung 76
4.8 Lerninduzierte Veränderungen der PKC im Gehirn der Honigbiene 77
4.9 Mögliche Funktionen der PKC Komplexbildung für die Etablierung von
Langzeitgedächtnis 79
5\. Zusammenfassung 82
6\. Literatur, Abkürzungsliste, Lebenslauf, Danksagung 84
Liste der verwendeten Abkürzungen 98
Lebenslauf 99
Danksagung 101
dc.description.abstract
In dieser Arbeit wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) bei nicht-
assoziativen und assoziativen Lernformen der Honigbiene Apis mellifera
untersucht. Mit Hilfe spezifischer Inhibitoren für die PKC bzw. deren
katalytisches Fragment PKM konnte die Funktion dieser Enzyme in
Verhaltensversuchen untersucht werden. Die Inhibition der PKC-Aktivität hatte
keinen Einfluss auf nicht-assoziative Lernformen wie Habituation oder
Sensitisierung. Beim assoziativen olfaktorischen Lernen zeigte sich, dass nur
die Inhibition der PKC, jedoch nicht die Blockierung der PKM zu Defekten bei
der Gedächtnisbildung führte. Die Aktivität der PKC ist dabei nur in einem
kurzen Zeitfenster von 1 - 2 Stunden nach der Konditionierung für die
Gedächtnisbildung notwendig. Die Untersuchungen der zugrunde liegenden
molekularen Mechanismen zeigten, dass sich die Menge der membrangebundenen PKC
aus den Pilzkörpern durch das assoziative Lernen veränderte. Unter Verwendung
von Antikörpern wurde zum gleichen Zeitpunkt (1-2 h nach der Konditionierung)
zu dem die Aktivität der PKC für die Gedächtnisbildung benötigt wurde, eine
Reduktion der PKC-Menge beobachtet. Mit Hilfe von Harnstoff und Trypsin konnte
nachgewiesen werden, dass es sich nicht um eine wirkliche Abnahme der PKC-
Menge, sondern um eine Maskierung der Antikörperbindestelle handelte. Diese
Maskierung beruhte auf der Interaktion der PKC mit anderen Proteinen. Die
Interaktion und Komplexierung der PKC wurde durch die Inhibition der PKC-
Aktivität, welche zu einer Reduktion bei der Gedächtnisbildung führte,
ebenfalls verhindert. Diese Ergebnisse zeigten, dass PKC in den Pilzkörper 1 ?
2 Stunden nach der olfaktorischen Konditionierung mit anderen Proteinen
interagiert und Komplexe bildet, und dass dieser Prozess an der Bildung von
Langzeitgedächtnis beteiligt ist. Um erste Hinweise auf mögliche
Interaktionspartner der PKC zu erhalten, erfolgte ein Vergleich der
Aminosäuresequenzen bekannter PKC Bindeproteinen mit einer Proteindatenbank
der Biene. Mit einem RACK1 ähnliche Protein wurde in der Biene ein PKC
Bindeprotein gefunden, dass alle Kriterien für die beobachtete Interaktion mit
PKC bei der Gedächtnisbildung erfüllt. Der immunhistologische Nachweis von dem
RACK1 ähnlichen Protein zeigte, dass es vor allem in den Kenyonzellen der
Pilzkörper und den Antennallobuszellen expremiert wird. Innerhalb der Kalyzes
konnte dabei eine deutlich höhere Immunreaktivität im Kern gegenüber dem
Zytosol beobachtet werden. Durch eine Immunpräzipitation wurde nachgewiesen,
dass aktivierte PKC an das RACK1 ähnliche Protein der Biene bindet. Somit
wurde erstmals eine Interaktion der Proteinkinase C mit Ankerproteinen im
Gehirn der Honigbiene nachgewiesen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse
darauf hin, dass diese Interaktion eine zentrale Rolle bei Prozessen der
Gedächtnisbildung spielen.
de
dc.description.abstract
This work investigates the role of protein kinase C in associative and non-
associative learning in the honeybee Apis mellifera. Using specific inhibitors
of PKC and the catalytic fragment PKM, we examined these enzymes? function in
memory formation. The experimental data show that inhibition of PKC has no
influence on non-associative learning such as habituation or sensitisation.
But the inhibition of PKC at one hour after associative learning causes a
significant reduction in memory, whereas inhibition before or after this
distinct time point affects neither learning nor memory formation. Inhibition
of PKM has no influence on associative and non-associative learning. Research
on the mechanisms underlying learning and memory have shown that in the
mushroom bodies the amount of PKC, which is located on the membrane, changed
after olfactory learning. The amount of PKC was determined using the ELISA-
technique at various time points after conditioning. Only at the distinct time
point at which PKC inhibition caused defects in memory formation was a
significant reduction observed in the amount of PKC. With the help of urea or
trypsin we determined that it is not a reduction in the amount of PKC, but a
blocking of the antibody binding site. This blocking depend on the interaction
of PKC with other proteins. Inhibition of PKC one hour after olfactory
conditioning, which causes a reduction in memory formation also prevents the
binding of PKC to other proteins. These data show that in the mushroom bodies
PKC interacts with proteins 1 ? 2 hours after olfactory conditioning and that
these protein-protein interactions are necessary for memory formation. An
Aligment of the amino acid sequences of already identified anchoring proteins
for PKC and an amino acid database of the honeybee showed that a protein
resembling RACK1 is found in the honeybee. Immunohistostaining of RACK1 showed
that this protein is mainly expressed in the Kenyon cells of the mushroom
bodies and in neurons of the antennal lobes. Within the calyces the
immunostaining was much more intensive in the nucleus than in the cytosol.
Immunoprecipitation demonstrated that RACK1 binds to activated PKC
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
protein kinase C
dc.subject
learning and memory
dc.subject
anchoring proteins
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Die Rolle der Proteinkinase C bei der Bildung von Langzeitgedächtnis
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Uli Müller
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Randolf Menzel
dc.date.accepted
2002-11-11
dc.date.embargoEnd
2002-12-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002614
dc.title.subtitle
Interaktion der PKC mit Ankerproteinen im Pilzkörper der Honigbiene Apis
mellifera
dc.title.translated
Function of protein kinase C in the formation of long-term memory
en
dc.title.translatedsubtitle
Interaction of PKC with anchoring proteins in the mushroom bodies of the
honeybee Apis mellifera
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000760
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/261/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000760
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free
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