Translokation der Proteinsynthese unter Hypoxie

Abstract

Die mRNA Translation, bzw. Proteinbiosynthese, gehört zu den intrazellulären Prozessen mit dem höchsten Energieverbrauch. Kommt es aufgrund eines anhaltenden Sauerstoffmangels (Hypoxie) zu einem Energiemangel, ist die Hemmung der Translation ein wichtiger Mechanismus um den Energiehaushalt anzupassen. Eine Sub-Gruppe von mRNAs kann sich jedoch der allgemeinen Suppression, die vor allem über die Regulation der Translationsinitiation kontrolliert wird, entziehen. Gene dieser Gruppe kodieren für Proteine, die das Überleben unter Hypoxie sicherstellen. Bisher wurde die Veränderung der mRNA Translationsrate unter Hypoxie hauptsächlich mittels Polysomengradientenanalyse untersucht. Dabei betrachtet man aber nur die zytoplasmatischen Polysomen. Andere Proteinsyntheseorte wie das raue endoplasmatische Retikulum (ER) werden dabei nicht berücksichtigt. Diese Arbeit untersucht die Rolle des ER für die aktive Proteinbiosynthese unter Hypoxie. Dazu wurden HT1080 Fibrosarkomzellen 36 h unter Kontrollbedingungen bzw. Hypoxie inkubiert. In individuellen als auch globalen Untersuchungen wurden die qualitative und quantitative mRNA Menge in Bezug auf ihre allgemeine Veränderung (Expression, Gesamtzellextrakte) sowie der mRNA Lokalisation am ER (ER-Extrakte) verglichen. Unter Hypoxie effektiv synthetisierte Gene, wie HIF-1α, HK2 und P4Hα(I), zeigten unter Sauerstoffmangel eine Transkriptanreicherung am ER unabhängig von der mRNA Konzentration im gesamten Fibroblasten. Ein Gegenbeispiel ist der Apoptosefaktor BLID, der zwar transkriptionell aktiviert wird, jedoch keine Anreicherung am ER unter Hypoxie zeigt. Bei der globalen Genexpressionsbetrachtung mittels Microarray Analyse waren Transkripte überlebenswichtiger Gene bevorzugt am ER lokalisiert. Es konnte eine signifikante ER-Anreicherung von Faktoren, die bspw. in Signalwegen wie der Glykolyse involviert sind, gezeigt werden. Insgesamt waren nur etwa 40% aller Transkripte, die verstärkt am ER lokalisiert waren, in ihrer Gesamtmenge erhöht, was auf eine hohe Selektivität der mRNA Translation am ER unter Hypoxie hinweist. Außerdem wurde eine Vielzahl von non-coding RNAs identifiziert, die ohne Steigerung ihrer Genexpression ans ER rekrutiert wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Art Neuformatierung der mRNA Translation am ER unter Hypoxie hin. Die These, dass es unter Hypoxie zu einer Translokation der Proteinsynthese ans ER kommt, kann in dieser Arbeit bestätigt werden. Das raue endoplasmatische Retikulum, als der effektivere Ort für die Proteinsynthese unter Hypoxie, könnte dabei als eine Art regulierender Filter der zelltypspezifischen Adaptation an Hypoxie fungieren.

Protein biosynthesis is one of the most energy consuming processes in cells. During hypoxia, suppression of translation is an important mechanism of cellular adaptation. A sub-group of mRNAs elude this general suppression by regulating translation initiation. Genes of this group encode for hypoxia survival proteins. To date, changes in mRNA translation during hypoxia have been mainly explored by polysomal gradient analysis, which takes into account only the cytoplasmic polysomes. Other locations of protein biosynthesis, for example, the endoplasmic reticulum (ER) are excluded. This thesis examines the role of the ER as a site for preferred protein biosynthesis during hypoxia. For this purpose, HT1080 fibrosarcoma cells were incubated for 36 hours under hypoxia and control conditions. The changes in global gene expression were compared and correlated with changes at the ER. Under hypoxia, highly induced genes like HIF-1α, HK2 and P4Hα(I) showed mRNA enrichment at the ER that was not dependent on their gene expression levels. On the other hand, the apoptosis factor BLID that was transcriptionally activated during hypoxia was not enriched at the ER. Microarray analysis revealed that transcripts of hypoxia survival genes, including factors that are involved in the glycolysis pathway, are favored for translation at the ER. The high selectivity of the mRNAs translated at the ER during hypoxia is further emphasized by the fact that only 40% of the transcripts that are enriched at the ER also showed induced gene expression. Furthermore, a high amount of non-coding RNAs were identified that were recruited to the ER without changes in gene expression levels. These results indicate a preference for mRNA translation at the ER during hypoxia. This thesis confirms that the site of protein biosynthesis is shifted to the ER during hypoxia. The rough endoplasmic reticulum is the more effective locus for translation under hypoxia and could function as a regulative filter for cell type specific adaptation to hypoxia.