Charakterisierung nuklearer Funktionen des Nichtstrukturproteins von Influenza B Virus

Abstract

Die NS1 Proteine von Influenza A und B Viren sind für eine effiziente Virusreplikation essentiell. Dies spiegelt sich in dem stark eingeschränkten Wachstum eines Influenza NS1 Deletionsvirus (A/delNS1; B/delNS1) wider. Interessanterweise replizierte A/delNS1 Virus effizient in IFN-defizienten Vero Zellen, wohingegen ein B/delNS1 Virus auf diesen Zellen stark eingeschränkt war (Dauber et al., 2004; Garcia-Sastre et al., 1998). Dieses Ergebnis deutet auf eine weitere für die Virusreplikation wichtige Eigenschaft des B/NS1 Proteins hin, welche von der Interferon-Antagonisierung verschieden ist. Neueste Forschungsergebnisse bringen das NS1 Protein von Influenza Virus in Verbindung mit dem durch das Rezeptorprotein Tap/NXF1 vermittelten mRNA Exportweg (Hao et al., 2008; Wang et al., 2008; Satterly et al., 2007). Da die viralen Transkripte von der viralen Polymerase synthestiert und die meisten Transkripte nicht prozessiert werden, werden sie per se nicht effizient von der nuklearen Exportmaschinerie erkannt (Palese and Shaw, 2007). Daher mussten Influenza Viren Mechanismen entwickeln, die eine Integration ihrer mRNA in einen nuklearen Exportweg erlauben. Interessanterweise akkumuliert das B/NS1 Protein in der frühen Infektionsphase in nuklearen Speckle-Domänen, jedoch konnte dieser Wechselwirkung bisher keine Funktion zugeordnet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Interaktionen des B/NS1 Proteins mit nuklearen Faktoren charakterisiert. Das B/NS1 Protein interagierte mit den nuklearen mRNA Exportproteinen UAP56 und Tap/NXF1 in GST- Kopräzipitationsassays und Immunfluoreszenzanalysen zeigten eine Kolokalisation der mRNA Exportfaktoren Aly/Ref und UAP56 mit B/NS1 in nuklearen Speckle-Domänen. Ferner spricht die Kopräzipitation viraler mRNA mit B/NS1 aus infizierten Zelllysaten für eine Funktion des Proteins im mRNA Export. Die Lokalisation des B/NS1 Proteins ist während des Infektionsverlaufes sehr dynamisch. In der frühen Infektionsphase ist es im Nukleus und zu späteren Zeitpunkten im Zytoplasma lokalisiert. Die N-terminalen Aminosäuren 46-56 wurden als ein nukleares Lokalisationssignal (NLS) identifiziert, welches die Bindung an den Importrezeptor Importin α vermittelte. Überraschend war, dass die basischen Aminosäuren im NLS auch für die Speckle-Lokalisation notwendig, aber nicht hinreichend waren. Die Expression von trunkierten B/NS1 Fragmenten im Kontext auto-fluoreszierender ß -Galaktosidase-GFP-Fusionsproteine ergab, dass die Aminosäuren 1-90 für eine Interaktion von B/NS1 mit Speckle-Domänen notwendig sind. Das verminderte Wachstum rekombinanter Influenza B Virusmutanten, welche NS1 Proteine mit eingeschränkter nuklearer Lokalisation und Speckle-Assoziation exprimierten, wies darauf hin, dass diese Eigenschaften wichtig für die Virusreplikation sind. Neben neuesten Ergebnissen, welche auf eine Funktion des Tap/NXF1 Rezeptors im nuklearen viralen mRNA Export hinweisen (Hao et al., 2008; Wang et al., 2008; Satterly et al., 2007), unterstützt diese Arbeit eine Funktion des viralen NS1 Proteins in diesem Prozess. Die Interaktion des B/NS1 Proteins mit nuklearen mRNA Exportproteinen, wahrscheinlich in Speckle-Domänen, und die Bindung an virale Transkripte in vivo sind Hinweise auf eine rekruitierende Funktion des B/NS1 Proteins, welche die Integration viraler Transkripte in den Tap/NXF1 mRNA Exportweg ermöglicht.

The NS1 proteins of influenza A and B virus are essential for full level virus replication. This is reflected by a strong attenuation of influenza NS1 deletion virus (A/delNS1, B/delNS1). Interestingly, the type A delNS1 virus can replicate efficiently in IFN-deficient Vero cells, whereas the B/delNS1 virus is strongly attenuated also in these hosts (Dauber et al., 2004; Garcia- Sastre et al., 1998). This suggests that the B/NS1 protein serves another important, yet unknown function in viral replication that is distinct from IFN suppression. However, recent data link the NS1 protein of influenza virus to the cellular Tap/NXF1 mediated mRNA export pathway (Hao et al., 2008; Wang et al., 2008; Satterly et al., 2007). The export of cellular mRNA is tightly coupled to transcription and processing events. Since viral mRNA is synthesized by the viral polymerase and most transcripts remain unprocessed they are per se not well recognized by the nuclear export machinery (Palese and Shaw, 2007). Therefore influenza viruses must have evolved mechanisms to integrate viral mRNA into a nuclear export pathway. Interestingly, it has been shown, that the NS1 protein of influenza B virus accumulates in nuclear speckle domains early in infection, but up to now no function has been connected to the protein’s nuclear localization. For the first time, this study characterized interactions of the B/NS1 protein with nuclear factors. The B/NS1 protein was shown to interact with the nuclear mRNA export proteins Tap/NXF1 and UAP56 in GST-coprecipitation assays. Immunofluorescence analysis showed a colocalization of the mRNA export proteins UAP56 and Aly/Ref with the B/NS1 protein in nuclear speckle domains, indicating that the interaction of B/NS1 and UAP56 takes place in these subdomains. In addition, viral transcripts coprecipitated with B/NS1 from infected cell lysates, supporting a role of the protein in viral mRNA export. The trafficking of the B/NS1 protein during infection is very dynamic. Early in infection the protein localized to the nuclear compartment, whereas late in infection it was localized in the cytoplasm. The N-terminal amino acids 46-56 were determined to comprise a nuclear localization signal (NLS), which mediated binding to the import receptor importin α in GST-coprecipitation assays. Surprisingly, the basic amino acids within the NLS were also necessary, but not sufficient for speckle localization. Expression of truncated B/NS1 fragments in an auto-fluorescent ß -galactosidase-GFP fusion protein revealed the N-terminal 90 amino acids to be necessary for speckle localization. The attenuation of recombinant influenza B viruses expressing NS1 mutant proteins with impaired nuclear localization and speckle association suggested that these properties contribute to viral propagation. In addition to recently published data, suggesting a function of the Tap/NXF1 receptor in the nuclear viral mRNA export (Hao et al., 2008; Wang et al., 2008; Satterly et al., 2007), this study supports a role of the viral NS1 protein in this process. The interaction of the B/NS1 protein with nuclear mRNA export factors and its in vivo association with viral mRNA may reflect a recruiting function of the protein which allows the integration of viral transcripts into the nuclear Tap/NXF1 mRNA export pathway.