dc.contributor.author
Banha Oliveira, João
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:47:23Z
dc.date.available
2016-04-21T12:42:18.160Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10986
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15184
dc.description.abstract
The development of novel drug target deconvolution methodologies is a growing
need in the pharmaceutical industry. The increased regulatory scrutiny demands
that better and safer medicines reach the consumer market and, for that, a
comprehensive characterization of the multiple targets and off-targets of the
drug early in the development process is a key success factor. Chemical
proteomics advances have provided the tools to study drug mechanisms of action
in a more direct and unbiased way than target-based screening strategies, by
analyzing the effects in the context of the full proteome from the target cell
or tissue of interest. Capture compound mass spectrometry (CCMS) is a robust
and versatile chemical proteomics technique due to the original design of the
probes. Capture compounds are trifunctional molecules that traditionally carry
a selectivity function, consisting of the small molecule under study, attached
to a scaffold bearing a tag, such as a fluorophore or biotin, and a UV-
reactive moiety protruding from the central core that covalently binds the
probe to the target protein. Although capture compounds are very efficient and
specific in targeting of even low affinity and low abundant targets, their use
has been limited so far to working with cellular lysates or targeting cell-
surface proteins. The main objective of this work was to advance CCMS to
implement and optimize workflows for the use of newly designed permeable
capture compounds to profile small molecule drugs in living cells, where the
targets are in their unaltered natural environment. Bio-orthogonal “click”
chemistry provides the prerequisite for the use of permeable capture compounds
bearing only the selectivity and reactivity functions, and a small “clickable”
chemical handle to bind and cross-link the targets in living cells and
afterwards specifically attach the sorting/detection function by a controlled
chemical click reaction such as the copper-assisted azide-alkyne cycloaddition
(CuAAC). Initial reaction parameters for the click reaction were tested using
a clickable cAMP capture compound in a solution of recombinant PKARI. The
optimization efforts in copper ion concentration, ligand nature, duration and
pH of the reaction, azide and alkyne concentrations yielded substantial
improvements from the starting point. Capturing PKA subunits from cell lysates
with the optimized parameters proved to be possible to use this workflow but
the results were not fully satisfactory. A capture compound with a non-natural
selectivity function was used to further develop target identification in cell
lysates and living cells using the new click reaction. The kinase inhibitor
dasatinib was profiled using this strategy and bona fide targets were
successfully identified using the clickable compound. ABL, BCR and SRC were
specifically identified in lysates and CSK, a known dasatinib binder, was
positively identified for the first time by chemical proteomics in living
cells. The newly established click workflow allowed to better characterize
phenobarbital, a drug that was developed as an anti-epileptic but elicits
unexplained hepatocarcinogenic effects in some species. The results of capture
experiments suggest that this small molecule interacts with several proteins
in the epidermal growth factor receptor signaling pathway and that the primary
target could be the transcription factor YBX1, and not the receptor itself as
it was suggested recently. A cell-based assay was developed to validate this
finding but was not further explored due to time constraints. In summary, the
strategy to identify small molecule targets in living cells using capture
compounds and bio-orthogonal chemo-selective ligation methods was successfully
established. This method provides the tools for a better characterization of
the target profiles of drugs and still has potential to be further innovated.
de
dc.description.abstract
Die Entwicklung neuer Methoden zur Dekonvolution der Profile von Zielproteinen
für pharmazeutische Wirkstoffe ist von wachsender Bedeutung für die
Pharmaindustrie. Eine umfassende Charakterisierung der Zielproteine
einschließlich sogenannter „Off-targets“ ist ein Schlüsselfaktor um bessere
und sicherere Medikamente auf den Markt zu bringen. Fortschritte in der
Chemischen Proteomanalyse bieten Werkzeuge für die direktere und bezüglich der
Zielproteine hypothese-freie Untersuchung der Wirkungsmechanismen von
Medikamenten, bei der die Bindung im Kontext des vollständigen Proteoms der
Zielzelle oder des Zielgewebes untersucht wird. Die Capture Compound
Massenspektrometrie (CCMS)-Technologie ist eine robuste und sehr flexibel
einsetzbare Technik in der chemischen Proteomanalyse. Capture Compounds sind
trifunktionelle Moleküle, die in ihrer klassischen Version eine
Selektivitätsfunktion tragen, die dem zu untersuchenden Kleinmolekül-Wirkstoff
entspricht, die mit einer Gerüststruktur verbunden ist, welche außerdem eine
Isolierungsfunktion sowie eine UV-aktivierbare Reaktivitätsfunktion für die
kovalente Verbrückung zum gebundenen Zielprotein enthält. Obwohl Capture
Compounds sehr effizient und spezifisch Zielproteine bindet, war ihr Einsatz
bislang wegen fehlender Permeabilität auf Zell-Lysate bzw. auf
Oberflächenproteine lebender Zellen beschränkt. Ziel der vorliegenden Arbeit
war die Weiterentwicklung der CCMS-Technologie durch Implementierung und
Optimierung des Einsatzes permeabler Capture Compounds neuartigen Designs zur
Profilierung von Kleinmolekül-Wirkstoffen in lebenden Zellen, in denen die
Zielproteine in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen. Bio-orthogonale
„Click“-Chemie bietet die Voraussetzung für den Einsatz permeabler Capture
Compounds, die lediglich die Selektivitätsfunktion, die Reaktivitätsfunktion
sowie eine kleine, „Click“-fähige chemische Gruppe enthalten. Bindung und
Verbrückung zu den Zielproteinen kann in den lebenden Zellen erfolgen, und
erst danach die Sortier-/Detektionsfunktion in einer kontrollierten chemischen
„Click“-Reaktion (wie z.B. die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition,
CuAAC) angebracht werden. Initiale Reaktionsbedingungen für die
„Click“-Reaktion wurden mit einer Capture Compound mit cAMP als
Selektivitätsfunktion in einer Lösung einer rekombinanten PKARI getestet. Die
Optimierung der Reaktion brachten substantielle Verbesserungen in der
Reaktionsausbeute im Vergleich zu den Startbedingungen. Um die Identifizierung
von Zielproteinen in Zell-Lysaten und lebenden Zellen unter Verwendung der
„Click“-Reaktion weiter zu entwickeln, wurde eine Capture Compound mit einer
anderen Selektivitätsfunktion verwendet. Das Kinaseinhibitor-Medikament
Dasatinib wurde mit dieser Strategie profiliert. Die bona fide Zielproteine
ABL, BCR, und SRC wurden spezifisch in Zell-Lysaten und zum ersten Mal CSK mit
chemischer Proteomanalyse in lebenden Zellen identifiziert. Der neu etablierte
methodische Arbeitsablauf ermöglichte es, Phenobarbital besser zu
charakterisieren, weil es in einigen Spezies hepatocarcinogen wirkt. Die
Ergebnisse der Capture-Experimente legen nahe, dass der primäre Binder der
Transkriptionsfaktor YBX1 sein könnte. Insgesamt konnte die Strategie,
Zielproteine von Kleinmolekül-Wirkstoffen in lebenden Zellen mit Hilfe
neuartiger Capture Compounds und bio-orthogonaler chemo-selektiver Ligation
erfolgreich etabliert werden. Diese Methode bietet ein Werkzeug für die
bessere Charakterisierung der Zielprotein-Profile von Medikamenten und hat das
Potential, noch weiter verbessert zu werden.
de
dc.format.extent
143, 2 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
drug target deconvolution
dc.subject
chemical proteomics
dc.subject
click chemistry
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::600 Technik::600 Technik, Technologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Identification of selected small molecule targets in living cells using
Capture Compounds™ through a bio-orthogonal chemical ligation method
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hubert Köster
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Markus Wahl
dc.date.accepted
2016-04-11
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000101785-2
dc.title.translated
Identifizierung von Kleinmolekül Zielproteinen in lebenden Zellen mit Capture
Compounds™durch Bio-orthogonale chemischen Ligation Verfahren
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000101785
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000019075
dcterms.accessRights.dnb
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open access