Malignitätsassoziierte Proteinexpressionsprofile von Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 und RAD51 in metastasierenden Mammatumoren des Hundes

Abstract

Tumore der Gesäugeleiste gehören zu den am häufigsten diagnostizierten Neoplasien beim Hund. Trotz der hohen Inzidenz ist die Ursache der Entwicklung und Progression bis heute nicht eindeutig geklärt. Aufbauend auf Untersuchungen zur mRNA-Expression von Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 und RAD51 in laser-mikro-dissezierten Mammatumoren sollte die vorliegende Arbeit Aufschluss über die Proteinexpressionsprofile dieser Gene geben, um ihre Rolle bei der Entstehung und Progression caniner Mammatumore näher zu untersuchen. Dazu wurde der Proteingehalt von Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 und RAD51 mittels immunhistochemischer Verfahren in neoplastisch unverändertem Mammagewebe, benignen und malignen Mammatumoren sowie ihren Lymphknotenmetastasen ermittelt. Die Auswertung der Derlin-1-Proteinexpression in der vorliegenden Arbeit erfolgte semiquantitativ und ergab eine verminderte Derlin-1-Expression in Adenomen während Adenokarzinome und ihre Lymphknotenmetastasen sowie insbesondere intravasale Tumorzellemboli eine signifikant erhöhte Derlin-1-Expression zeigten. Die ermittelten Proteinexpressionen decken sich mit den vorhandenen mRNA-Daten aus früheren Untersuchungen, bei denen eine signifikant höhere Expression in Lymphknotenmetastasen im Vergleich zum Primärtumor festgestellt werden konnte. Die Proteinexpression von Derlin-1 in malignen Mammatumoren weist auf eine verstärkte Stresssituation insbesondere von intravasalen Tumorzellemboli hin, die sekundär zu einem Anstieg der Derlin-1- Proteinexpression geführt hat. Andererseits könnte der Anstieg der Derlin-1-Expression auch eine primäre Voraussetzung für die erfolgreiche Metastasierung von Tumorzellen sein. Bisherige Untersuchungen von TGF-β, LTBP-4 und p27 in caninen Mammatumoren auf transkriptioneller Ebene zeigten eine verminderte Expression im neoplastischen Gewebe im Vergleich zum Normalgewebe auf. Dies konnte durch die vorliegende Arbeit auf Proteinebene bestätigt werden. Dabei zeigten sowohl benigne als auch maligne Mammatumore ein signifikant vermindertes TGF-β-, LTBP-4- und p27-Proteinexpressionsniveau im Vergleich zum Normalgewebe. Beim Vergleich der Tumorgruppen Adenom, Adenokarzinom und Lymphknotenmetastase konnten für TGF-β und p27 keine deutlichen Unterschiede der Immunreaktivität beobachtet werden. Im Gegensatz dazu war für LTBP-4 eine stärkere Proteinexpression in der Gruppe der Adenome erkennbar, die signifikante Unterschiede zum malignen Gewebe erkennen lies. Es kann somit angenommen werden, dass der Expressionsverlust der drei Proteine direkt mit der Karzinogenese caniner Mammatumore in Verbindung steht, wobei der Verlust von TGF-β und p27 als ein früher Schritt in der Entstehung caniner Milchdrüsentumore angesehen werden kann. Das RAD51 -mRNA-Expressionsniveau in caninen Mammatumoren zeigte in früheren Arbeiten einen Malignitäts-assoziierten Expressionsanstieg auf mit einem Maximum in der Gruppe der Lymphknotenmetastasen. Diese Feststellung konnte in den vorliegenden Untersuchungen auf Proteinebene nur teilweise bestätigt werden. Die Proteinexpression von RAD51 zeigte eine signifikante Überexpression neoplastischer Gewebe im Vergleich zum Normalgewebe auf. Darüber hinaus war das RAD51-Proteinexpressionslevel in Adenokarzinomen höher als in den Adenomen. Diskrepanzen ergaben sich hingegen bei der Analyse des Proteinexpressionsprofils von RAD51 in Lymphknotenmetastasen, die eine deutlich verminderte Expression im Vergleich zur Gruppe der Adenokarzinome aufwiesen. Anhand der ermittelten Proteindaten kann angenommen werden, dass die verstärkte Expression von RAD51 in neoplastischen Geweben als ein Indikator für genomische Instabilität angesehen werden kann und eine Beteiligung an der Karzinogenese caniner Mammatumore wahrscheinlich ist. Dabei könnte die Reduktion der Expression in Lymphknotenmetastasen mit einem Selektionsprozess von Tumorzellen mit verminderter RAD51-Expression während der metastatischen Progression im Zusammenhang stehen. Weiterhin konnte in den verschiedenen Geweben eine signifikante positive Korrelation zwischen der TGF-β- und p27- bzw. eine negative Korrelation der TGF-β- und RAD51- Proteinexpression festgestellt werden. Aufgrund der mitunter fehlenden signifikanten Unterschiede der Proteinexpressionen zwischen Adenomen und Adenokarzinomen und der teilweise aufwendigen Quantifizierung erscheint die Eignung von Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 und RAD51 als Tumor- bzw. Malignitätsmarker als fraglich. Insgesamt zeigte sich, dass maligne Tumore durch eine verminderte Proteinexpression von TGF-β, LTBP-4 sowie p27 und eine erhöhte Derlin-1- und RAD51-Expression gekennzeichnet sind. Alle fünf Proteine scheinen somit potenziell einen direkten oder indirekten Einfluss auf die Progression caniner Mammatumore haben zu können.

Mammary tumors are the most common neoplasia in dogs. The cause of the mammary tumor carcinogenesis is far from being understood despite it´s high incidence. Based on recent findings that show a transcriptional dysregulation of Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 and RAD51 in laser microdissected tissue samples of canine mammary tumors, the aim of the following study was to analyze the protein expression profiles of these genes in benign and malignant canine mammary tumors. For that purpose Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 and RAD51 were quantified immunohistochemically in non-neoplastic canine mammary gland, adenomas, adenocarcinomas and lymph node metastases of canine mammary tumors. Derlin-1 was evaluated semiquantitatively and revealed weak to moderate expression in nonneoplastic mammary tissue and adenomas but expression was significantly increased in adenocarcinomas and lymph node metastases. Furthermore, intralymphatic tumor cells had significantly higher Derlin-1 expression levels. These protein expression levels are similar to mRNA expression levels found in an earlier study in the same subset of tumors. The increased protein expression of Derlin-1 in malignant canine mammary tumors and in particular in intravasal tumor cells suggest that these cells are exposed to increased levels of cellular stressors. However, it is also possible that an increased Derlin-1 expression is not merely a reaction but a primary cause for a successful metastatic spread of tumor cells. Previous studies revealed decreased TGF-β, LTBP-4 and p27 mRNA expression levels in canine mammary tumors when compared to non-neoplastic mammary gland. In the present study a similar decrease in protein expression levels were detected. Both benign and malignant mammary tumors showed significantly reduced protein expression levels of TGF-β, LTBP-4 and p27 when compared to normal mammary gland. However, no significant differences in TGF-β and p27 expression levels could be detected when adenomas, adenocarcinomas and lymph node metastases were compared. LTBP-4 protein expression was higher in adenomas when compared to malignant mammary gland. It seems therefore possible that loss of TGF-β, LTBP-4 and p27 protein expression is directly associated with a more malignant behaviour of canine mammary tumors, whereas the decreased expression of TGF-β and p27 may be an early step in the development of canine mammary tumors. RAD51 mRNA expression are increased in neoplastic tissue when compared to normal mammary gland with a maximum expression in lymph node metastases. In the present study increased RAD51 protein expression levels could be confirmed for neoplastic tissue when compared to non-neoplastic mammary glands. Furthermore, primary carcinomas had increased RAD51 protein expression when compared with adenomas. However, the decreased RAD51 protein expression in lymph node metastases when compared to primary tumors was surprising and is in contrast to earlier studies on mRNA expression levels. By virtue of the identified protein data it can be assumed that the increased expression from RAD51 in neoplastic tissue can be regarded as an indicator for genomic instability and probably as a participant in the carcinogenesis of canine mammary tumors. The different expression levels in primary tumors and their lymph node metastases seem to be associated with a selective process during metastatic progression. A significant positive correlation between TGF-β and p27 and a negative correlation of the TGF-β and RAD51 protein expression could also be detected. Nevertheless, the lack of significant differences of Derlin-1, TGF-β, LTBP-4, p27 and RAD51 protein expression between benign and malignant mammary neoplasia of the dog hinders the use as a marker for tumor cells and malignancy for this tumor type. Altogether we showed that malignant tumors had a reduced protein expression of TGF-β, LTBP-4 and p27 and an increased Derlin-1 and RAD51 expression level. All of these five proteins appear to have a potential direct or indirect influence on the progression of canine mammary tumors.