Investigation of the mechanism of Epstein-Barr virus Latent Membrane Protein 1 mediated NF-kB activation

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is an oncogenic herpes virus that causes human disease including Hodgkin’s disease and Naso-Pharyngeal Carcinoma. Latent membrane protein 1 (LMP1), expressed in these malignancies, mimics a constitutively active TNF receptor (TNFR). LMP1 has two C-terminal cytosolic domains, transformation effector sites (TES)1 and -2, that engage TNFR- associated death domain proteins (TRADD and RIP) and TNFR-associated factors (TRAFs), which interact with signaling molecules to activate NF-κB. The transcription factor NF-κB regulates expression of numerous genes. Constitutively active NF-κB is implicated in various lymphoid malignancies. NF-κB activation relies on the IκB kinase (IKK) complex which is composed of IKKα, IKKβ, and the regulatory subunit NEMO. NEMO has been proposed as a universal adaptor of the IKK complex for various stimuli such as TNFα, IL-1, HTLV-1 Tax, and KSHV v-FLIP. This study demonstrates that NEMO is essential for LMP1 TES2 mediated NF-κB activation. Beyond that, we identified two NEMO mutations that uniquely support LMP1 dependent NF-κB activation, whereas they can not support TNFα, Tax, TPA or CD40-mediated NF-κB activation. The first mutation 1-372, generates a truncated NEMO protein which lacks the putative zink finger located at the C-terminus. The second mutation Δ133-224, generates a truncated NEMO protein which has an internal deletion. Reconstitution experiments in NEMO knockout MEFs, indicate that the NEMO zink finger and the region aa133-224 are dispensable for LMP1 mediated NF-κB activation, but are required for TNFα mediated NF-κB activation. The double mutant 1-372/ Δ133-224 failed to reconstitute LMP1 mediated NF-κB activation, suggesting that the zink finger and the region aa133-224 likely have a redundant function for LMP1 signaling, whereas both are essential for TNFα mediated NF-κB activation. Further we show that the UBAN domain and leucine zipper (LZ) of NEMO are required for TNFα, Tax, or LMP1 mediated NF-κB activation, indicating that ubiquitin modifications within the ubiquitin binding domain and/ or the ability of NEMO to recognize ubiquitin chains, are essential for activation of NF-κB by all stimuli tested. In siRNA experiments, TRAF6 was found to be required for LMP1 mediated NF-κB activation. Collectively, TRAF6 mediated K63-linked polyubiquin chains (possibly attached to NEMO) are required for LMP1 mediated NF-κB activation. Additionally, the reconstitution assay suggests that: (1) the lack of requirement of the NEMO zink finger indicates that binding to K63-linked polyubiquitin chains is not required for LMP1 mediated NF-κB activation and that binding to linear polyubiquitin chains may be sufficient, or (2) the region aa133-224 interacts with a protein that co- operates with the UBAN domain to mediate recognition and binding to K63-linked polyubiquitin chains similar to the function of the zink finger.

Epstein-Barr virus (EBV) ist ein krebserregendes Herpes Virus, daß Hodgkin’s disease und Naso-Pharyngeal Carcinoma auslöst. Das latente Membran Protein (LMP1), welches in diesen Krankheiten exprimiert ist, ahmt einen Tumor Nekrose Faktor (TNF)-Rezeptor nach, der permanent aktiv ist. An seinem C-ende hat LMP1 zwei Domänen, TES1 und -2, welche mit TNFR-assoziierten Todes Domäne Proteinen (TRADD und RIP) und TNFR-assoziierten Faktoren (TRAFs), interagieren und NF-κB aktivieren. Der Transkriptions Faktor NF-κB reguliert die Expression zahlreicher Gene. Übermäßige Aktivierung von NF-κB steht in Zusammenhang mit Leukemien. Wichtig für die Aktivierung von NF-κB ist der IκB Kinase (IKK) Komplex, der sich aus zwei Kinasen, IKKα und IKKβ, sowie der regulatorischen Untereinheit NEMO zusammensetzt. NEMO funktioniert als ein universeller Adapter, der NF-κB aktivierende Signale, einschließlich TNFα, IL-1, HTLV-1 Tax und KSHV v-FLIP in den IKK Komplex integriert. Diese Arbeit demonstriert, dass NEMO für LMP1 TES2 vermittelte NF-κB Aktivierung notwendig ist. Es wurden zwei Mutationen in NEMO identifiziert, welche ausschließlich LMP1 vermittelte NF- κB Aktivierung bewirken, nicht jedoch TNFα, Tax, TPA oder CD40 vermittelte. Die erste Mutation, 1-372, erzeugt ein NEMO Protein, dem der Zinkfinger am C-ende fehlt. Die zweite Mutation, Δ133-224, führt zu einem verkürzten Protein dem intern 91 Aminosäuren fehlen. Rekonstruktionsexperimente in NEMO-/- MEFs offenbaren, dass der NEMO Zinkfinger und die Region aa133-224 für LMP1 vermittelte NF-κB Aktivierung entbehrlich sind, jedoch für TNFα vermittelte NF-κB Aktivierung benötigt werden. Der Doppelmutant, 1-372/ Δ133-224, konnte LMP1 vermittelte NF-κB Aktivierung nicht wiederherstellen, was darauf hinweist, dass der Zinkfinger und die Region aa133-224 eine austauschbare Funktion im LMP1 Signalweg haben, während beide Regionen für TNFα unverzichtbar sind. Der NEMO Leucine zipper und die Ubiquitin bindungs Domäne (UBAN) sind für NF-κB Aktivierung aller getesteten Stimuli unverzichtbar. Weiterhin fanden wir in siRNA Experimenten, dass TRAF6 für LMP1 vermittelte Aktivierung von NF-κB in Wildtyp und den beiden Jurkat Zelllinen notwendig ist. Weiterhin stellten wir fest, dass TRAF6 mit Wildtyp NEMO und den beiden Mutanten 1-372 und Δ133-224 co-immunoprezipitiert. Zusammenfassend, diese Experimente demonstrieren, dass im Gegensatz zu TNFα, von TRAF6 hergestellte (möglicherweise an NEMO angebrachte) K63-verbundene Ubiquitin Ketten für LMP1 vermittelte Aktivierung von NF-κB unverzichtbar sind. Die Rekonstruktionsexperimente legen 2 Modelle nahe: (1) da der NEMO Zinkfinger entbehrlich ist, ist Erkennung und Bindung an K63-verbundene Ubiquitin Ketten für LMP1 vermittelte NF-κB Aktivierung nicht erforderlich, oder (2) die Region aa133-224 interagiert mit einem Protein, daß mit der UBAN domäne kooperiert und Bindung an K63-verbundene Ubiquitin Ketten vermittelt, ähnlich der Funktion des Zinkfingers.