Family 4 glycoside hydrolases (GH4) represent an unusual group of glucosidases with a requirement for NAD+, divalent metal cations and reducing conditions. The family is also unique in its inclusion of both alpha- and beta-specific enzymes. The alpha-glucosidase A, AglA, from Thermotoga maritima is a typical GH4 enzyme, requiring NAD+, Mn2+ and strongly reducing conditions for activity. This work presents the crystal structure of the apo-protein refined to 1.8 Å and of AglA complexed with NAD+ and maltose refined to 1.9 Å resolution. They reveal that the NAD+ molecule is bound to a typical Rossman- fold NAD-binding site, and that the nicotinamide moiety is localised close to the maltose substrate. Within the active site the conserved Cys174 and surrounding conserved histidines are positioned in a way suggesting a role in the hydrolysis reaction. Previous biochemical studies on AglA have shown that the purified protein has only a low level of activity which is quickly lost, but is partially re-attainable for a brief time through treatment with high concentrations of reductants. The electron density maps indicate that Cys174 is oxidized to a sulfinic acid. Most likely, the strongly reducing conditions are necessary to reduce this oxidised cysteine side chain. Notably, the canonical set of catalytic acidic residues common to other glucosidases is not present in the active site, suggesting an unusual mechanism of action for a glycoside-hydrolysing enzyme. Additionally, AglA displays no structural similarity to other characterized glycosyl hydrolases, but high structural homology to NAD-dependent dehydrogenases. From the results of this study it is proposed that family 4 represents a new structural clan of glycosyl hydrolases.
Die Mitglieder der Glycosylhydrolase-Familie 4 (GH4) stellen eine ungewöhnliche Gruppe von Glycosidasen dar, da sie für vollständige Aktivität NAD+, divalente Metallionen und reduzierende Bedingungen benötigen. Darüber hinaus ist diese Familie einzigartig, weil sie sowohl Mitglieder mit alpha- als auch mit beta-Spezifität bzgl. der Konfiguration am anomeren Zentrum der hydrolysierten Substrate umfasst. Die alpha-Glucosidase A, AglA, aus dem Organismus Thermotoga maritima ist ein repräsentatives Mitglied dieser Familie, da es NAD+, divalente Metallionen und stark reduzierende Bedingungen benötigt. Diese Arbeit stellt die Kristallstrukturen des Apo-Proteins, verfeinert zu einer Auflösung von 1.8 Å, und von AglA im Komplex mit NAD+ und Maltose, verfeinert zu einer Auflösung von 1.9 Å, vor. Sie zeigen, dass das NAD+-Molekül gebunden an eine typische NAD-Bindungstasche einer Rossman- Faltung vorliegt und dass die Nicotinamid-Gruppe nahe dem Maltosemolekül positioniert ist. Die Lagen des konservierten Cys174 und benachbarter konservierter Histidin-Reste legen nahe, dass sie eine Rolle in der Hydrolyse- Reaktion spielen. Frühere biochemische Arbeiten an AglA zeigten, dass das gereinigte Protein nur eine niedrige Aktivität aufweist, die aber durch Zugabe von Reduktionsmitteln in hohen Konzentrationen für kurze Zeit partiell wieder hergestellt werden kann. Die Elektronendichtekarten zeigen, dass Cys174 zur Sulfinsäure oxidiert vorliegt. Sehr wahrscheinlich sind die stark reduzierenden Bedingungen daher nötig, um die oxidierte Cystein-Seitenkette wieder zu reduzieren. Bemerkenswerterweise findet sich im aktiven Zentrum von AglA nicht der für andere Glycosidasen typische, kanonische Satz von zwei sauren katalytischen Resten, was auf einen für Glycosylhydrolasen ungewöhnlichen Reaktionsmechanismus hinweist. Außerdem zeigt AglA keine strukturelle Ähnlichkeit zu anderen charakterisierten Glycosidasen, wohl aber hohe strukturelle Homologie zu NAD-abhängigen Dehydrogenasen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie wird daher vorgeschlagen, dass die GH4-Familie einen neuen Strukturklan der Glycosylhydrolasen konstituiert.
