Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte die erste systematische Untersuchung zu röntgeninduzierten Modifikationen des PSII-Mangankomplexes. Durch Röntgenabsorptionsmessungen konnte gezeigt werden, dass es schon nach wenigen Minuten Bestrahlung durch hochintensive Synchrotronstrahlungsquellen zu einer Ein-Elektronen-Reduktion kommt, die mit signifikanten Strukturveränderungen verbunden ist. Die Reduktionsrate ist dabei stark vom Oxidationszustand des Metallzentrums abhängig. Eine längere Bestrahlung führt zur vollständigen Zerstörung des Komplexes unter Bildung von Mn(II). Zudem zeigt die gefundene Temperaturabhängigkeit der Photoreduktion, dass proteinspezifische Bewegungen einen Einfluss auf die Strahlenchemie besitzen. Eine ähnlich klare Korrelation zwischen der Rate eines physiko-chemischen Prozesses und der Temperaturabhängigkeit der Proteindynamik ist bisher nicht berichtet worden. Diese Ergebnisse sind von wesentlicher Bedeutung in Hinblick auf Strukturuntersuchungen an Röntgenstrahlungsquellen. Ein Messplatz zur Rekombinationsfluoreszenz des PSII wurde erstellt, der single-shot-Messungen bei einer Abnahme der Signalintensität um mehr als vier Größenordnungen und über vier Dekaden im Zeitbereich ermöglicht. Es konnte gezeigt werden, dass die zeitaufgelöste Detektion der Rekombinationsfluoreszenz eine gut geeignete Methode zur Untersuchung der Elektronentransfer-Prozesse des PSII ist. Im Gegensatz zu anderen Messmethoden, wie sie in der Vergangenheit vorrangig für die Untersuchung der Redoxprozesse des PSII verwendet wurden (Absorptionsmessungen), ist dieser Ansatz nicht durch die Lichtstreuung der Probe limitiert. Dadurch und durch das hervorragende Signal-Rausch-Verhältnis werden Messungen über einen wesentlich längeren Zeitbereich (~50 ms) nach der Ladungstrennung ermöglicht. Durch Analyse der Blitzabhängigkeit der Rekombinationsfluoreszenz wurde der Einfluss verschiedener Parameter auf den miss-Parameter des S-Zyklus untersucht und die optimalen Bedingungen für ein Voranschreiten im katalytischen Zyklus ermittelt. Die verschiedenen Ursachen, die zu miss-Ereignissen führen, wurden quantifiziert und es konnte gezeigt werden, dass der Hauptverlustprozess die Rekombination des ladungsseparierten Zustandes ist (~8 % Rekombination). Durch die Bestimmung von Extinktionskoeffizient und Wirkungsquerschnitt konzentrierter PSII-Proben wurden die Bedingungen ermittelt, unter denen in Beblitzungsexperimenten eine vollständige Anregung aller Photosysteme in der Probe gewährleistet ist. Die hier gewonnenen Ergebnisse sind von Relevanz für alle Arten von Experimenten, bei denen die S-Zustände des Mangankomplexes durch kurze Lichtblitze gezielt populiert werden. Die Änderung der freien Energie, die mit der Bildung des ladungsseparierten Zustandes YZ+QA- verbunden ist, wurde durch vergleichende Messungen von prompter und Rekombinationsfluoreszenz bestimmt. Damit war es möglich, die Redoxpotentiale des P680 und des Tyrosin-Z abzuleiten (+1,26 bzw. +1,22 V), die einer direkten Messung nicht zugänglich sind. Die hier ermittelten Werte sind positiver als bisher angenommen, was von unmittelbarer Relevanz für den Mechanismus der katalytischen Wasserspaltung ist. Im Gegensatz zu einer neueren Studie, die zu ähnlichen Resultaten gelangt, wurden die in der hier vorliegenden Arbeit bestimmten Redoxpotentiale aus direkt ermittelten DG-Werten abgeleitet und beruhen ausschließlich auf Experimenten, die an PSII-Membranfragmenten eines einzigen Organismus durchgeführt wurden. Die dem sauerstoffentwickelnden S3 ® S0-Übergang vorausgehende energetische Relaxation des ladungsseparierten Zustandes YZQA- (µs-Phasen des Elektronentransfers vom YZ zum P680+) wurden untersucht. Diese mit Protonenbewegungen gekoppelte Relaxation steht vermutlich in direktem funktionellen Zusammenhang mit der katalytischen Wasserspaltung am Mangankomplex. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Bestimmung des entropischen Beitrages zur Relaxation (Entropiezunahme), der pH-Abhängigkeit des Prozesses sowie durch Analyse der Kinetik der Reaktion gezeigt werden, dass während der Relaxation eine komplex verlaufende Deprotonierungsreaktion stattfindet, die mit einer Protonenfreisetzung in das wässrige Medium verbunden ist. Höchstwahrscheinlich handelt es sich um einen Protonentransport vom katalytischen Zentrum zur Proteinoberfläche, der vor dem S3 ® S0-Übergang stattfindet. Zusammen mit neuesten zeitaufgelösten Röntgenabsorptionsmessungen führen diese Ergebnisse zu einer neuen Interpretation der Schritte unmittelbar vor der Sauerstoffentwicklung.
In this work the first systematic investigation to X-ray induced modifications of the PSII manganese complex is presented. It could be shown by X-ray absorption measurements that already after few minutes of irradiation by high- intensive sources of synchrotron radiation a one-electron reduction takes place, which is correlated with significant structural changes. The reduction rate depends strongly on the oxidation state of the metal center. Longer irradiation leads to the complete destruction of the complex and to formation of Mn(II). The found temperature dependence of the photo-reduction shows that protein-specific movements possess an influence on radiation chemistry. These results are of substantial importance in view to structural investigations at X-ray sources of high intensity. A measuring system for the recombination fluorescence of PSII was build. It could be shown that time-resolved detection of the recombination fluorescence is a well suitable method for the investigation of the electron transfer processes of PSII. Contrary to other measuring methods, used with priority in the past for the investigation of the redox processes of the PSII (absorption measurements), this method is not limited by the light scattering of the sample. Thus and by the outstanding signal-to-noise ratio measurements are possible over a substantially longer time interval (~50 ms) after the light-flash induced charge separation. The influence of different parameters on the miss-parameter of the S-cycle was examined by analysis of the flash number dependence of the recombination fluorescence and the optimal conditions for progressing in the catalytic cycle were determined. The different mechanisms, which lead to misses, were quantified and it could be shown that the main loss process is the recombination of the charge-separated state (~8 % recombination). By measurements of the extinction coefficient and the cross-section of photochemistry of PSII the conditions that ensure a complete excitation of all photosystems in the sample were determined. The results are of relevance for all kinds of experiments, where the S-states of the manganese complex are populated by means of short light-flashes. The change in free energy upon formation of the charge-separated state YZ+QA- was determined by comparative measurements of prompt and recombination fluorescence. It was possible to derive the redox potentials of P680 and Tyrosin-Z (+1.26 and +1.22 V, respectively), which are not accessible to a direct measurement. The values determined here are more positive than so far estimated, which is of direct relevance for the mechanism of the water splitting process at the manganese complex. In contrast to a recent study, in which similar values are found, the redox potentials in the here presented work are derived on basis of direct measured free energy values and they are based exclusively on data of PSII membrane-fragments of only one organism. The energetic relaxation of the charge-separated state YZ+QA- (µs-phases of the electron transfer from YZ to P680+), which precedes the oxygen-evolving S3-S0-transition were examined. This relaxation is coupled with proton movements and is probably involved functionally in the catalytic water splitting process at the manganese complex. By determination of the entropic contribution to the relaxation (entropy increase), the pH dependence of the process as well as by analysis of the kinetics of the reaction it is shown that during the relaxation a complex deprotonation reaction takes place, which is correlated with a proton release into the aqueous medium. Most likely a proton transport from the catalytic center to the protein surface takes place, which precedes the S3-S0-transition. Together with recent time-resolved X-ray absorption measurements these results lead directly to a new interpretation of the reactions occurring directly before the oxygen-evolving step.