Untersuchung Ca2+-aktivierter Ionenkanäle in Epithelien des Auges

Abstract

Ein kontrollierter Ionen- und Wassertransport ist essentiell für die Funktionsfähigkeit von Strukturen des Auges, von denen die Sehfähigkeit direkt abhängt: die Linse und das retinale Pigmentepithel (RPE). In der Linse bewirkt ein Ungleichgewicht des Ionenhaushalts einen Verlust der Transparenz. Verantwortlich ist eine erhöhte Kationenpermeabilität der Epithelzellmembranen, der die Aktivierung Ca2+-aktivierter Kationenkanäle zugrunde liegen könnte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde deshalb die funktionelle Expression und molekulare Identität solcher Kanäle im humanen Linsenepithel untersucht. Sowohl in primären Linsenepithelzellen als auch in HLE B 3 Zellen aktivierte das Ca2+-Ionophor Ionomycin einen nicht-selektiven Kationenkanal. Durch Analyse des Kationenkanalexpressionsmusters, der biophysikalischen Eigenschaften und des pharmakologischen Profils konnte dieser Kanal als TRPM2 identifiziert werden. Kataraktogene Faktoren steigerten die Aktivität des in der Zytoplasmamembran der Linsenepithelzellen lokalisierten TRPM2: H2O2 aktivierte es, transforming growth factor (TGF)-β2 verstärkte die Expression und den Strom von TRPM2. TRPM2 wird demnach funktionell in humanen Linsenepithelzellen exprimiert, wo es maßgeblich an der Leitfähigkeit und dem Potential der Zellmembran beteiligt ist und aufgrund seiner Aktivierung durch kataraktogene Faktoren in Linsentrübungen involviert sein kann. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit dem elektrophysiologischen Verhalten des RPE. Es stellt durch einen streng kontrollierten Ionen- und Wassertransport die Integrität der Retina als neuronale Einheit des Auges sicher. Eine wichtige Rolle spielt der basolateral lokalisierte Ca2+-aktivierte Cl--Kanal (CaCC). Dieser Teil der Arbeit widmete sich der Frage, ob es sich bei dem CaCC im RPE um Anoctamin-2 (Ano2) handelt, dem er in seinen Eigenschaften ähnlich ist. In Ganzzellableitungen wurde durch verschiedene Cl--Kanal-Blocker die funktionelle Expression eines CaCC in ARPE 19 Zellen und primären murinen RPE-Zellen bestätigt, wobei ATP als physiologisches Stimulanz zur Erhöhung des intrazellulären Ca2+ diente. Eine siRNA-Herunterregulierung der Ano2-Expression führte zu einer Reduzierung des Cl--Stroms. Die Studie zeigt, dass Ano2 an der Cl--Leitfähigkeit des RPE maßgeblich beteiligt ist. Zusammen mit Frederik Fried und Dr. Nadine Reichhart wurde die Regulierung des Ca2+-leitenden Ionenkanals TRPV2 in ARPE 19 Zellen untersucht. TRPV2-Ströme wurden durch Erhitzen der Badlösung auf 45 °C induziert. Einen deutlich stärkeren Stromanstieg bewirkten Cannabidiol und insulin-like growth factor (IGF) 1 durch eine Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-abhängige Erhöhung der Oberflächenexpression. Somit kann eine Steigerung der TRPV2-Aktivität durch exogene Agonisten zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führen und möglicherweise Ano2 aktivieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass in der Linse ein Ca2+-aktivierter TRP-Kanal und im RPE Ano2 funktionell exprimiert und ihre Aktivitäten durch verschiedene, mitunter pathologische, Faktoren modifiziert werden. Dies legt den Grundstein für weitere Untersuchungen, inwieweit die beiden Kanäle in den physiologischen Ionen- und Wassertransport sowie in assoziierte pathologische Ereignisse involviert sind.

A regulated transport of ions and water is essential for ocular structures on which vision directly depends: the crystalline lens and the retinal pigment epithelium (RPE). In the lens, an ion imbalance results in the loss of transparency caused by an increased cation permeability of epithelial cell membranes, which might be a result of the activation of Ca2+-activated cation channels. Thus, in the first part of this thesis, functional expression and molecular identity of such channels were investigated. The Ca2+-ionophore ionomycin activated a non-selective cation channel in both primary lens epithelial and HLE B-3 cells. By analysis of cation channel expression pattern, biophysical properties, and pharmacological profiling, the channel was identified as TRPM2. Cataractogenous factors increased the activity of TRPM2, which was localized in cytoplasm membranes of lens epithelial cells: H2O2 activated TRPM2; transforming growth factor (TGF)-β2 increased the expression and current of TRPM2. Thus, TRPM2 is functionally expressed in human lens epithelial cells, where it strongly participates in the conductance and the potential of the cell membrane. Due to its activation by cataractogenous factors, TRPM2 might be involved in lens opacification. The second part of the work dealt with the electrophysiological behavior of the RPE. By precise control of the ion and water transport, the RPE ensures integrity of the retina as neuronal component of the eye. The basolateral localized Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) plays an important role. This part of the thesis addressed the question if the CaCC is anoctamin-2 (Ano2), which resembles the CaCC in the RPE. Whole-cell measurements and different Cl- channel blockers confirmed functional expression of a CaCC in ARPE-19 cells and primary murine RPE cells, where ATP served as physiological stimulus in order to increase intracellular Ca2+. Down-regulation of Ano2 expression by siRNA approaches decreased the Cl- current. This study demonstrates that Ano2 participates significantly to the Cl- conductance of the RPE. In cooperation with Frederik Fried and Dr. Nadine Reichhart, regulation of the Ca2+-conducting ion channel TRPV2 in ARPE-19 cells was examined. TRPV2 currents were induced by heating the bath solution to 45 °C. By a phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-dependent increase of surface expression, cannabidiol as well as insulin-like growth factor (IGF) 1 led to a current increase that was significantly larger than that of heating alone. Thus, enhancement of TRPV2 activity by exogenous agonists may increase intracellular Ca2+ concentration and possibly activate Ano2. In summary, these studies show that a Ca2+-activated TRP channel is functionally expressed in the lens, and Ano2 is functionally expressed in the RPE. In addition, it has been found that the activity of both might be modified by different, possibly pathological, factors. These results may serve as the basis for further studies, how far specifically the activity of both channels is involved in the physiological transport of ion and water, or with regard to associated pathological events.