Molekulare Konjugate mit neuartiger Zielfindungsstruktur zur Verbesserung des Gentransfers

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei wesentliche Ziele auf dem Gebiet des Gentransfers mittels nichtviraler Vektoren untersucht. Zum einen sollte durch „Zelluläres Targeting“ der Gentransfer in die Zielzelle und damit die Gentransfereffizienz gesteigert werden. Zum anderen sollte durch „Intranukleäres Targeting“ längere Transgenexpression auf hohem Niveau erreicht werden. Durch die Charakterisierung hoch affiner Liganden für den Rezeptor-vermittelten Gentransfer sollte die Gentransfereffizienz und damit die Transgenexpression in den Zielzellen gesteigert werden. Als mögliches Target wurde die Expression des Prostacyclin (IP1) Rezeptors auf pulmonalen Epithelzelllinien mittels Western Blot untersucht. Hierbei konnte ein positiver Rezeptorstatus sowohl auf Alveolar- als auch auf Bronchialepithelzellen bestätigt werden, was einen Einsatz von Liganden für die Ansteuerung dieses Rezeptors ermöglichte. Iloprost (ILO) und Treprostinil (TRP), zwei Prostaglandin I2 Analoga und stabile Agonisten am IP1 Rezeptor, wurden an Fluorescein markiertes Rinderserumalbumin (BSA) als Modellvehikel kovalent gebunden und hinsichtlich ihrer Zellbindung bzw. Aufnahme in Alveolar- und Brochialepithelzellen untersucht. Hierbei zeigte das ILO Konjugat eine 2 bis 4-fach höhere Bindung bzw. Aufnahme, verglichen mit dem TRP Konjugat. Durch Ko-Inkubation von freiem ILO sowie eines selektiven IP1-Rezeptorantagonisten war eine Inhibierung der Bindung bzw. Aufnahme möglich. Da für einen effizienten Gentransfer die Rezeptor-vermittelte Aufnahme ins Zytoplasma essentiell ist, wurde dies mittels konfokaler Laserrastermikroskopie nach Inkubation der BSA-ILO Konjugate untersucht. Hierbei war eine deutliche Bindung und Internalisierung der Konjugate verglichen mit unkonjugiertem BSA nachweisbar. Um nun die Gentransfereffizienz zu überprüfen wurde ILO kovalent an verzweigtes Polyethylenimin 25 kDa (PEI) konjugiert. Dabei resultierten PEI-g-ILO Konjugate mit unterschiedlichen Kopplungsgraden (FILO (ILO:PEI)= 2, 5, 8, 16). Diese wurden hinsichtlich DNA- Bindung, Partikelgröße und Transfektionseffizienz untersucht. Unter optimierten Bedingungen (N/P 4, FILO=5) zeigten die PEI-g-ILO Gen-Vektor Nanopartikel nach Zugabe von Heparansulfat eine vollständige Freisetzung der Plasmid-DNA aus dem Gen-Vektor Komplex. Auch die Partikelgröße war mit etwa 80 nm vergleichbar mit unmodifizierten PEI Gen-Vektor Nanopartikeln. Die Transfektion von Alveolar- und Bronchialzelllinien mit PEI-g-ILO Gen-Vektor Nanopartikeln unter optimierten Bedingungen (N/P 4, FILO=5) zeigte eine 46-fach signifikante Steigerung des Gentransfers. Dieser Effekt konnte wie schon bei den BSA-Konjugaten mit einem selektiven IP1-Rezeptor-Antagonisten gehemmt werden. Aufgrund der hohen Transfektionseffizienz war eine Dosisreduktion in vitro von PEI-g-ILO Gen-Vektor Nanopartikeln um 50 Prozent im Vergleich zu PEI möglich. Dabei konnte das gleiche Expressionsniveau erreicht werden. Interessant war, dass bei der Untersuchung der Signaltransduktion nach Inkubation von PEI-g-ILO Gen-Vektor Nanopartikeln sich ein Anstieg der cAMP Konzentration zeigte. Dieser machte deutlich, dass ILO auch nach kovalenter Bindung an PEI fähig war eine physiologische Antwort nach Rezeptorbindung zu vermitteln. Positive Effekte von Prostaglandin I2 Analoga wie beispielsweise eine antiinflammatorische Wirkung könnten hier einen zusätzlichen Nutzen bei der Applikation vor allem in pathologischem Gewebe bringen. In vivo konnte die Genexpression in den Lungen von BALB/c Mäusen nach Aerosolapplikation mittels Kompressionsvernebler in einer Ganzkörpervernebelungskammer mit PEI-g-ILO Gen-Vektor Partikeln im Vergleich mit PEI um das 14-fache gesteigert werden. Desweiteren zeigten toxikologische Untersuchungen, verglichen mit PEI Gen-Vektor Nanopartikeln, keine erhöhte Zelltoxizität nach Transfektion in vitro sowie keinen signifikanten Anstieg an inflammatorischen Zytokinen im Serum. Um durch „Intranukleäres Targeting“ längere Transgenexpression zu erreichen, wurde versucht gezielt episomal (=extrachromosomal) replizierende Plasmid-DNA in transkriptionsaktive Bereiche der Nukleären Matrix mittels einer „Nuclear Matrix Targeting Signal“ (NMTS) Peptidsequenz zu steuern. Bekannt war, dass durch Einführung der huINF β-Scaffold Matrix Attachment Region (S/MAR) in Plasmid-DNA die episomale Replikation in hämatopoetischen Zellen vermittelt werden konnte. Allerdings musste nach Transfektion dieser S/MAR Vektoren ein mehrwöchiger initialer Selektionsdruck angewendet werden, um episomale Replikation und damit Langzeitexpression in Zellen zu erreichen. Mit der Entwicklung von S/MAR-NMTS Hybridvektoren sollte daher eine einzigartige Möglichkeit geschaffen werden, stabile Langzeittransgenexpression ohne Selektionsdruck auf hohem Niveau zu vermitteln. Die Peptidsequenz sollte helfen, diese S/MAR Vektoren in die transkriptionsaktiven Bereiche des Zellkerns zu transportieren und daher in Kombination mit der S/MAR die episomale Replikation zu begünstigen. Die NMTS Peptidsequenz des hämatopoetischen AML-1B Transkriptionsfaktors wurde sowohl über Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) als auch über chemische Kopplung mittels „Aziridine Labeling Reagenz“ (ALR) an S/MAR Vektoren gebunden. Die über PNAs gekoppelte NMTS war jedoch nicht in der Lage nach Transfektion in Jurkat Zellen Langzeit-Transgenexpression zu vermitteln. Dies lag mit großer Wahrscheinlichkeit an der Tatsache, dass nach PNA Bindung an Plasmid-DNA deren Replikation gestört war. Die chemisch-kovalente Bindung der NMTS über ALR an S/MAR Vektoren führte ohne Selektionsdruck mit einem Konjugationsgrad von FNMTS (NMTS:S/MAR Vektor)= 3 verglichen mit unmodifiziertem S/MAR Vektor nach Nukleofektion zu einer signifikanten bis zu 100-fach höheren relativen Expression des Reportergens über 30 Tage hinweg. Dieser Effekt schien allerdings nicht auf die NMTS zurückzuführen zu sein, da sowohl eine mutierte als auch randomisierte NMTS Peptidsequenz bei gleichem Konjugationsgrad ähnlich hohe Expressionswerte aufwiesen. Interessant war jedoch, dass nach quantitativer real-time PCR nach 30 Tagen eine 10 bis 20 Prozent höhere Integration der mit den Peptiden (NMTS, Mutante, Randomisiert) modifizierten S/MAR Vektoren nachweisbar war. Dies war unabhängig von der Transfektionsmethode. In weiteren Untersuchungen konnten hydrophobe Effekte sowie Effekte integrierter S/MAR Konjugate auf die Langzeitexpression ausgeschlossen werden. Als mögliche Ursache für die höhere Integration nach Transfektion und damit Langzeitexpression zeigte sich ein sichtbar hoher Anteil an offenkettig-zirkulärer Plasmid-DNA der S/MAR Konjugate in der Agarosegelelektrophorese. Nach semiquantitativer Auswertung konnte gezeigt werden, dass alleine die Konjugation mit ALR zu einem 150 bis 200-prozentigen Anstieg der offenkettig-zirkulären Form der Plasmid-DNA führte.

This thesis aimed at addressing two main objectives in the field of non viral gene transfer. Firstly, by “Cellular Targeting”, enhanced gene transfer into the target cell was attempted. Secondly, “Intranuclear Targeting” was investigated as a means to achieve sustained transgene expression at high levels. Cellular Targeting primarily comprised characterizing high affinity ligands for receptor-mediated gene transfer thereby increasing the gene transfer efficiency and transgene expression in target cells. As a possible target, the expression of prostacyclin (IP1) receptor was investigated in pulmonary epithelial cell lines by western blot analysis. A positive receptor status in both, alveolar- and bronchial epithelial cells could be confirmed. These results formed the basis for using a ligand for targeting this receptor. Iloprost (ILO) and treprostinil (TRP), two prostaglandin I2 analogues and stable receptor agonists of the IP1 receptor were bound covalently to fluorescein labeled bovine serum albumin (BSA) as a model vehicle. The resulting molecular conjugates were analyzed for their cell binding or uptake into alveolar- and bronchial epithelial cells. The ILO conjugate showed a 2 to 4 times higher binding or uptake, compared with the TRP conjugate. In competitive binding experiments, incubation of free ILO and/or excess of a specific IP1 receptor antagonist resulted in inhibition of the binding or uptake. As uptake into the cytoplasm is essential for efficient gene transfer, cytoplasmic uptake was investigated by confocal laser scanning microscopy after incubation of the BSA-ILO conjugates on cells. A distinct internalization of the conjugates compared to unconjugated BSA was detectable. In order to verify the gene transfer efficiency, ILO was covalently conjugated to branched polyethylenimine 25 kDa (PEI). This PEI-g-ILO conjugates resulted in different degrees of coupling (FILO (ILO: PEI) = 2, 5, 8, 16). These were analyzed for DNA binding, particle size and transfection efficiency. Under optimized conditions (N/P 4, FILO= 5) PEI-g-ILO gene vector particles after the addition of heparan sulfate showed a complete release of the plasmid DNA from the gene-vector complex. In addition the particle size was approximately 80 nm comparable to gene vector nanoparticles with unmodified PEI. Transfection of alveolar- and bronchial epithelial cells with PEI-g-ILO gene vector nanoparticles under optimized conditions (N/P 4, FILO= 5) showed a 46-fold significant increase in gene transfer. This effect could be inhibited with a specific IP1 receptor antagonist. Due to the high transfection efficiency in vitro, it was possible to achieve gene expression levels comparable to PEI with only half the amount of PEI-g-ILO gene vector nanoparticles. Investigations into the physiological activity of ILO after coupling to PEI via cAMP measurements provided evidence for the functionality of the ligand post conjugation. Incubation of cells with PEI-g-ILO gene vector nanoparticles resulted in an increase in cAMP indicating that ILO, covalently bound to PEI, was also able to give a physiological response to receptor binding. Positive effects of prostaglandin I2 analogues, such as an anti- inflammatory effect could add further value to the application of PEI-g-ILO conjugated in vivo especially in pathological tissue. In vivo gene expression in lungs of BALB/c mice after aerosol application of PEI-g-ILO gene vector particles in a whole body nebulization chamber could be increased to 14-fold, compared with PEI. Furthermore, toxicological studies showed, compared with PEI gene vector nanoparticles, no increased cytotoxicity after transfection in vitro and no significant increase in inflammatory cytokines in the serum. To achieve sustained transgene expression by “Intranuclear Targeting”, an attempt was made to target episomal (=extrachromosomal) replicating plasmid DNA into transcriptionally active areas of the nuclear matrix by means of a “Nuclear Matrix Targeting Signal” (NMTS) peptide sequence. It has been previously shown that introduction of the huINF β-Scaffold Matrix Attachment Region (S/MAR) in plasmid DNA could mediate episomal replication in hematopoietic cells. However, after transfection of these S/MAR vectors, an initial selection pressure of several weeks was necessary to achieve episomal replication and thus long term expression. Development of S/MAR-NMTS hybrid vectors offer a unique opportunity to mediate long-term stable transgene expression without selection pressure. In principle the peptide sequence should help to transport these S/MAR vectors into transcriptionally active areas of the nucleus and therefore favor episomal replication in combination with the S/MAR sequences. The NMTS peptide sequence of the hematopoietic transcription factor AML-1B was bound to S/MAR vectors by Peptide Nucleic Acids (PNAs) and via chemical coupling using Aziridine Labeling Reagent (ALR). The NMTS peptide coupled via PNAs was not able to achieve long-term transgene expression after transfection into Jurkat cells. This was most likely due to lack of DNA replication after binding of the PNA to plasmid DNA. The chemical-covalent binding of the NMTS via ALR to S/MAR vectors with a coupling degree of FNMTS (NMTS:S/MAR Vector) = 3 led to a significant up to 100-fold higher relative expression of the reporter gene about 30 days post nucleofection without any selection pressure, compared with unmodified S/MAR vectors. This effect could not be attributed to the NMTS function of the peptide as both a mutated and scrambled NMTS peptides, at the same coupling degree showed similar high expression ratios. Quantification of the transgene by real time PCR, at the end of the long-term expression experiments, revealed 10 to 20 percent higher integration of the peptide (NMTS, Mutant, Scrambled) modified S/MAR vectors. The amount of integration was independent of the transfection method. In further investigations, hydrophobic effects and effects of integrated S/MAR sequences on the long-term expression could be excluded. A possible reason for the higher integration and long-term expression after transfection, could be the high proportion of open-circular plasmid DNA of the S/MAR conjugates visible in the agarose gel electrophoresis. Semiquantitative image analysis showed that the conjugation with ALR alone led to a 150 to 200 percent increase in open-circular form of plasmid DNA.