dc.contributor.author
Seifert, Stefanie
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:38:11Z
dc.date.available
2011-04-14T12:21:29.567Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10759
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14957
dc.description
Table of content
.................................................................................................
4 Acknowegements
..............................................................................................
7 List of abbreviations
.........................................................................................
9 List of figures
...................................................................................................
11 List of tables
....................................................................................................
12 1\. Summary
.......................................................................................................
13 1.1 English summary
.....................................................................................
13 1.2 Deutsche Zusammenfassung
.................................................................. 15 2\.
Introduction
....................................................................................................
17 2.1 Microglia – immune defense of the brain
................................................. 17 2.2 Cellular responses to
stab wound injury ................................................... 19 2.4
Potassium channels in microglia
.............................................................. 20 2.5
Neuropeptid and –transmitter receptors
................................................... 22 2.6 The calcium sensor
GCaMP2 .................................................................. 26
3\. Aim
................................................................................................................
27 4\. Material and methods
....................................................................................
29 4.1 Material
....................................................................................................
29 4.1.1 Drugs and chemicals
......................................................................... 29
4.1.2 Media and buffers
..............................................................................
31 4.1.3 Fluorescent probes, enzymes and antibodies
................................... 32 4.1.4 Kits
....................................................................................................
33 4.1.5 Cells
..................................................................................................
33 4.1.6 Devices
..............................................................................................
34 4.1.7 Software
............................................................................................
34 4.2 Methods
...................................................................................................
35 4.2.1 Microglia preparations
........................................................................... 35
5 4.2.1.1 Microglia cultures from neonatal mouse brain
................................ 35 4.2.1.2 Microglial cultures from adult
mouse brain - Percoll isolation ......... 35 4.2.1.3 Microglial cultures from
juvenile and adult mouse brain - isolation from whole brain cultures
............................................................... 36 4.2.1.4
Acute brain slice preparation
.......................................................... 36 4.2.2 Cell
culture assays
................................................................................
37 4.2.2.1 Proliferation assay
.......................................................................... 37
4.2.2.2 Cytokine assay
...............................................................................
37 4.2.2.3 NO assay
........................................................................................
38 4.2.3 Retroviral gene transfer
......................................................................... 38
4.2.3.1 Retroviral vectors
............................................................................
38 4.2.3.2 Production of retroviral vector particles
.......................................... 39 4.2.3.3 In vitro transduction
........................................................................ 40
4.2.3.4 Induction of the stab wound and transduction in vivo
..................... 40 4.2.4 Physiological methods
.......................................................................... 41
4.2.4.1 Patch clamp experiments
............................................................... 41 4.2.4.2
Calcium imaging
.............................................................................
42 4.2.5 Immunohistochemistry
.......................................................................... 43
4.2.6 Statistics
................................................................................................
43 5\.
Results...........................................................................................................
44 5.1 Electrophysiological characterization of adult microglia
........................... 44 5.1.1 Microglial cells from different
preparations ........................................ 44 5.1.2 Adult microglia
isolated by Percoll gradient ....................................... 46 5.1.3
Adult microglia from whole brain cultures
.......................................... 51 5.2 Retroviral gene transfer – a
tool to study microglial cells ......................... 55 5.2.1 Expression
of a calcium sensor in vitro ............................................. 55
5.2.2 Microglia properties are not changed by the retrovirus
...................... 57 5.3 Expression of eGFP in vivo
...................................................................... 60 6
5.3.1 Identification and characterization of virus transduced microglial cells
by patch clamp technique in acute brain slices ......................... 60
5.3.2 Identification and quantification of microglial cells by
immunohistochemistry
...................................................................... 64 5.4
Expression of a calcium sensor in vivo
.................................................... 66 5.4.1 Intracellular
calcium increase in response to ATP in acute brain slices
.................................................................................................
66 5.4.2 Calcium transients in response to substance P
................................. 68 5.4.3 Calcium transients in response to
endothelin-1 ................................. 70 5.4.4 Calcium transients in
response to histamin ....................................... 72 5.4.5 Calcium
transients in response to serotonin ...................................... 74
5.5 Microglia in vitro respond to serotonin but not to substance P
................. 77 6\. Discussion
.....................................................................................................
78 6.1 Comparison of adult microglia from different preparations
....................... 78 6.2 Retroviral genetransfer of GCaMP2 as a tool to
study microglia .............. 80 6.3 Expression of eGFP in vivo
...................................................................... 81 6.4
Expression of a calcium sensor in vivo
.................................................... 84 6.4.1 Retroviral
genetransfer as a tool to study microglia in situ ................ 84 6.4.2
ATP and substance P sensitivity differ between activated and deactivated
microglia/brain macrophages ........................................ 85 6.4.3
A larger population of microglial cells in situ is sensitive to endothelin-1,
histamine, substance P and serotonin as compared to culture
...........................................................................................
87 6.4.4 The role of microglial neurotransmitter and –hormone sensitivity in
physiology
.........................................................................................
87 6.4.5 The role of microglial neurotransmitter and –hormone sensitivity in
pathology
..........................................................................................
88 7\. Bibliography
...................................................................................................
90 8\. Appendix
......................................................................................................
113 Curriculum Vitae
............................................................................................
115
dc.description.abstract
Microglial cells are the resident immune cells of the brain and are important
for fight against microorganisms, clearance of damaged tissue and scar
formation. If the brain gets injured microglial cells transform from a resting
to an activated stage. The physiological changes that accompany with microglia
activation are not fully understood in the adult brain, because so far
adequate models to study the cells are misssing. Microglia were investigated
mainly in cell culture prepared from neonatal rodends. A few recent studies on
microglia from adult animals advert that these cells differ in their
physiological properties compared to cultured microglia from neonatals.
Therefore I investigated the physiology of microglia cells of the adult brain
in the present work. First I characterized cultured microglia cells from the
adult brain by patch clamp technique and compared them to microglial cells
from neonatal mice. Following properties could be identifyed: (1) Adult
cultured microglia cells exhibit in general less inward and outward currents
then cultured microglial cells from neonatal brains. (2) The current
amplitudes were increasing culturing time. (3) The amplitude and conductance
of inward currents in unstimmulated microglia was age dependent, whereas
outward currents did not differ. (4) Adult microglia from distant brain
regions, namely cerebral cortex and corpus callosum did not differ in their
current profiles. (5) Upon mimicing bacterial infection by stimulation with
LPS, adult microglia were able to induce outward currents. Unexpectedly
microglia from juvenilles where not able to develop outward currents upon LPS
stimulation. In vitro studies show that microglia express a variety of
neurotransmitter and neuropeptide receptors which are linked to Ca2+ dependent
pathways. This signaling molecules were found to modulate important microglia
functions. In the second part of this work I introduce a new approach which
allowed me to extent calcium measurements to microglia in the brain tissue
environment of adult mice. A retrovirus encoding for eGFP or a calcium sensor
protein (GCaMP2) was injected into the cortex of mice two days after
microglial proliferation was stimulated by a stab wound. 3, 6, 21 and 42 days
after the stab wound injury acute brain slices were prepared. Characterization
of the eGFP positive cells in the side of injury by patch clamp experiments
and by antibody staining identified them as highly activated microglial cells
at 3 and 6 days. EGFP positive cells at day 42 showed properties of resting
microglia. Upon GCaMP2 expression transient intracellular Ca2+ increase in
response to of ATP, endothelin-1, substance P, histamine and serotonin
application were recorded. The fluorescence amplitude to ATP was higher at day
6 in comparison to all other time points. The responses to all other ligands
did not differ significantly between the time points. About half of the
microglial cells that responded to ATP also responded to endothelin-1,
serotonin and histamine. Only substance P at day 6 showed a complete overlap
with the ATP responding microglial population, while at day 42 this population
was reduced to 55 %. Adult microglia in the brain slice showed an increased
responsiveness to the tested ligands in comparison to cultured microglia from
neonatal mice. My studies support the hypothesis that adult microglia differ
in their physiology from microglia of neonatal mice. The present results are
contributing to the better understanding of brain injury of adults.
de
dc.description.abstract
Mikrogliazellen sind die Immunzellen des Gehirns und sind für die Verteidigung
gegen Mikroorganismen, die Säuberung von zerstörtem Gewebe und für
Narbenbildung von Bedeutung. Im Falle einer Gehirnverletzung wechseln
Mikroglia von einem ruhenden in einen aktivierten Zustand. Die physiologischen
Veränderungen im Gehirn eines Erwachsenen, die mit Mikrogliaaktivierung
einhergehen nicht vollständig verstanden, weil geeignete Modelle zum Studium
der Zellen fehlen. Mikroglia wurden bisher hauptsächlich in Zellkultur
untersucht, welche aus neugeborenen Nagetieren gewonnen wurden. Einige wenige
kürzlich angefertigte Untersuchungen an Mikroglia von erwachsenen Tieren
weisen darauf hin, dass sich diese Zellen in ihren physiologischen
Eigenschaften von kutivierten Mikrogliazellen aus neugebornen Tieren stammend
unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit habe ich daher die Physiologie von
Mikroglia des Gehirns von erwachsenen Mäusen untersucht. Zunächst habe ich
kultivierte Zellen des erwachsenen Gehirns mittels Patch Clamp-Technik
untersucht und diese mit Mikrogliazellen von neugebornen Mäusen verglichen.
Folgende Eigenschaften könnten dabei identifiziert werden: (1) Erwachsene
kultivierte Mikrogliazellen zeigen generell weniger Einwärts- und
Auswärtsströme als kultivierte Mikroglia von Gehirnen Neugeborener. (2) Die
Stomamplitude war abhängig von der Kultivierungszeit. (3) Die Amplitude und
Leitfähigkeit der Einwärtsströme von unstimmulierten Mikrogliazellen war
altersabhängig, wärend sich die Auswärtsströme nicht unterschieden. (4)
Erwachsene Mikroglia von verschiedenen Gehirnregionen, namentlich cerebraler
Kortex und Corpus callsoum unterschieden sich nicht in ihren Stromprofilen.
(5) Nach Imitation einer bakteriellen Infektion mittels LPS, waren adulte
Mikroglia in der Lage Auswärtströme induzieren. Unerwarteterweise konnten
Mikroglia von jugendlichen Mäusen keine Auswärtsströme entwickeln. In vitro-
Studien zeigen, dass Mikroglia eine Vielzahl an Neurotransmitter- und
Neuropeptid-Rezeptoren exprimieren, welche mit Kalzium abhangigen Signalwegen
verbunden sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit stelle ich einen neuen Ansatz
vor, welcher mir erlaubt Kalziummessungen an Mikrogliazellen auf das
Gehirngewebe von erwachsenen Mäusen auszuweiten. Ein Retrovirus, welcher
entweder für eGFP oder das Calciumsensorprotein GCaMP2 codiert, wurde in das
Gehirn von Mäusen injeziert, zwei Tage nach dem Mikrogliazellen mittels
Stichwundenverletzung zur Proliferation angeregt wurden. 3, 6, 21 und 42 Tage
nach Stichwundenverletzung wurden akute Hirnschnitte vorbereitet. Die
Charakterisierung der eGFP positiven Zellen nahe der Verletzung mittels Patch
Clamp-Experimenten und Antikörperfärbung ergab, dass es sich haupsächlich um
aktivierte Mikrogliazellen an Tag 3 und 6 handelte. EGFP positive Zellen an
Tag 42 zeigten Eigenschaften von ruhenden Mikrogliazellen. Nachdem GCaMP2 in
den Zellen exprimiert wurde konnte ich vorrübergehende intrazelluläre
Kalziumerhöhungen als Antwort auf die Applikation von ATP, Endothelin-1,
Substanz P, Histamin und Serotonin messen. Die Fluoreszenzamplitude war an Tag
6 im Gegensatz zu allen anderen Zeitpunkten erhöht. Die Antworten der anderen
Liganden unterschieden sich nicht zwischen den Zeitpunkten. Ungefähr die
Hälfte der Zellen, die auf ATP reagierten, antworteten auch auf Endothelin-1,
Serotonin und Histamin. Nur Substanz P zeigte eine komplette Übereinstimmung
mit der auf ATP reagierenden Zellpopulation an Tag 6, wärend an Tag 42 nur
noch 55% der Zellen reagierten. Erwachsene Mikrogliazellen im Gehirnschnitt
zeigten ein erhöhtes Antwortverhalten gegenüber den getesten Liganden im
Vergleich zu kultivierten Mikrogliazellen von neugeborenen Mäusen. Meine
Untersuchungen unterstützen die Hypothese, dass sich erwachsene Mikroglia in
ihrer Physiologie von Mikrogliazellen neugeboerner Mäuse unterscheiden. Die
vorliegenden Ergebnisse werden dazu beitragen Gehirnverletzungen von
Erwachsenen besser zu verstehen.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
stab wound injury
dc.subject
neurotransmitter
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Electrophysiological properties and intracellular calcium recordings of
microglial cells from the adult brain
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Fritz Rathjen
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Helmut Kettenmann
dc.date.accepted
2011-03-31
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000022204-6
dc.title.translated
Elektrophysiologische Eigenschaften und intrazelluläre Kalzium-Messungen an
Mikrogliazellen des adulten Gehirns
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000022204
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000009326
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open access