dc.contributor.author
Gehring, Niels Henrik
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:35:28Z
dc.date.available
2002-11-20T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10687
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14885
dc.description
TITEL UND INHALT 1
1 EINLEITUNG 6
1.1 Die Bedeutung des humanen Genoms 6
1.2 Kontrolle der Genexpression 9
1.2.1 Das Konzept eines regulierten Transkripts 10
1.3 Die Blutgerinnung 15
1.3.1 Kontrolle der Blutgerinnung 17
1.3.2 Hereditäre Störungen der Blutgerinnung 17
1.4 Nonsens-vermittelter mRNA-Abbau 19
1.4.1 Modelle des NMD 20
1.4.2 Die Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD 23
1.4.3 Die Komponenten des NMD beim Menschen 25
2 ABKÜRZUNGEN 28
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 Mikrobiologische Methoden 31
3.1.1 Bakterienstämme 31
3.1.2 Phagen 31
3.1.3 Herstellung elektrokompetenter Bakterien und Elektroporation 31
3.2 Kultur eukaryontischer Zellen 32
3.3 Transfektion eukaryontischer Zellen 32
3.3.1 BBS/Kalziumphosphat Methode 32
3.3.2 HBS/Kalziumphosphat Methode 33
3.4 Plasmid-Konstrukte 34
3.5 In vitro Mutagenese 39
3.5.1 PCR in vitro Mutagenese 40
3.5.2 In vitro Mutagenese mit Uracil-haltiger einzelsträngiger DNA 40
3.6 Sequenzierung von DNA 41
3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 42
3.8 Plasmid-Präparation im Mini-Maßstab 42
3.9 Plasmid-Präparation im Midi-, Maxi- und Mega-Maßstab 42
3.10 RNA-Präparation aus eukaryontischen Zellen 42
3.10.1 Präparation von zytoplasmatischer Gesamt-RNA 42
3.10.2 Präparation nukleärer Gesamt-RNA 43
3.10.3 Fraktionierung von zytoplasmatischer Gesamt-RNA in
poly(A)-angereicherte und poly(A)-abgereicherte RNA 43
3.11 Ribonuklease-Protektions-Analyse 43
3.12 RNA-Analyse mittels Northern-Blot 45
3.13 In vitro Transkription 46
3.14 Primer-Extension-Analyse 47
3.14.1 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden 48
3.15 LM-PAT-Assay 48
3.16 RT-PCR 49
3.17 Proteinextraktion 49
3.17.1 Proteinbestimmung 50
3.18 Immunpräzipitation 50
3.19 Protein-Analyse mittels Immunblot 50
3.20 Puffer und Lösungen 51
3.21 Medien für Bakterienkultur 54
3.22 Reagenzien und Materialien 55
3.22.1 Chemikalien 55
3.22.2 Antikörper 56
3.22.3 Laborkunststoffwaren 56
3.22.4 Enzyme 56
4 ERGEBNISSE 57
4.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A
Mutation 57
4.1.1 Experimentelles System 58
4.1.2 Die F2 20210 G>A Mutation führt zu erhöhter mRNA- und Protein-
Akkumulation 59
4.1.3 Die F2 20210 G>A Mutation erhöht die mRNA Expression auf post-
transkriptionaler Ebene 60
4.1.4 F2*A und F2*G mRNAs weisen identische Poly(A)-Schwänze und 3?UTRs auf 63
4.1.5 Die Mutation F2 20210 G>A bewirkt eine Erhöhung der 3'End-
Prozessierungs-effizienz 65
4.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 69
4.2.1 Experimentelles System 70
4.2.2 Hybrid-mRNAs aus HBB und H1F3 werden korrekt am 3?Ende prozessiert 71
4.2.3 Hybrid-mRNAs bilden funktionelle Histon 3?Enden 74
4.2.4 Demonstration der eisenabhängigen Translationsregulation im
experimentellen System 75
4.2.5 Nicht-polyadenylierte Hybrid-mRNAs mit Histon 3?Enden unterliegen dem
Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 77
4.2.6 Die verringerte Expression der Nonsens-mutierten Hybrid-mRNAs ist
spleißabhängig 80
4.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus
84
4.3.1 Das experimentelle lambdaN/boxB beta-Globin-System 85
4.3.2 Untersuchung potentieller NMD-Faktoren 92
4.3.3 Funktionelle Analyse von Deletionsmutanten von hUpf3b 92
4.3.4 Punktmutationen im Bereich 421-434 interferieren mit der NMD-Wirkung von
hUpf3b 97
4.3.5 Der C-Terminus von hUpf3b ist notwendig aber nicht hinreichend um NMD zu
vermitteln 98
4.3.6 Die Aminosäuren 421-434 von hUpf3b vermitteln die Interaktion mit Y14
101
4.3.7 Y14 ist ein starker Vermittler von NMD 103
4.3.8 Y14 ist ein bona fide Mediator des NMD 104
5 DISKUSSION 107
5.1 Untersuchung des molekularen Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A
Mutation 107
5.1.1 Ein neuartiger Mechanismus einer hereditären Erkrankung 107
5.1.2 Auswirkungen der 3?End-Prozessierungseffizienz auf die Prothrombin-
Expression 109
5.1.3 Fazit 109
5.1.4 Ausblick 110
5.2 Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim Nonsens-vermittelten mRNA-Abbau 112
5.2.1 Die Kopplung der Polyadenylierung und anderer RNA-
Prozessierungsreaktionen 114
5.2.2 Fazit 114
5.2.3 Ausblick 114
5.3 Charakterisierung von Komponenten des Nonsens-vermittelten mRNA-Abbaus 115
5.3.1 Charakterisierung von hUpf3b-Domänen im NMD 118
5.3.2 Identifizierung von Y14 als bona fide NMD-Mediator 120
5.3.3 Fazit 121
5.3.4 Ausblick 121
6 ZUSAMMENFASSUNG 125
7 SUMMARY 127
8 BIBLIOGRAPHIE 129
dc.description.abstract
Krankheitsverursachende Mutationen befinden sich häufig innerhalb des offenen
Leserahmens von mRNAs, wo sie Struktur und Funktion des gebildeten Proteins
beeinflussen. Eine Reihe von hereditären Erkrankungen wird jedoch nicht durch
Mutationen hervorgerufen, die solche offensichtlichen Auswirkungen haben,
sondern verschiedene Schritte des mRNA-Metabolismus verändern. In dieser
Arbeit wurden am Beispiel zweier krankheitsverursachender Mutationen
posttranskriptionale Mechanismen der Genexpressionsveränderung untersucht. Im
ersten Teil wurde der molekulare Mechanismus der Prothrombin 20210 G>A
Mutation untersucht. Diese Mutation stellt einen der häufigsten genetischen
Risikofaktoren für das Auftreten von Thrombosen dar und betrifft etwa 1-2% der
Bevölkerung. Die G>A Transition verändert das letzte Nukleotid der 3'UTR der
mRNA und verursacht erhöhte Prothrombin-Plasmakonzentrationen, die eine
wichtige Rolle bei der Pathogenese der Krankheit spielen. Meine Untersuchungen
zeigen, daß die G>A Mutation eine verstärkte Verwendung der 3'End-
Prozessierungsstelle bewirkt, da das normale Prothrombin 3'End-Prozessierungs-
signal ineffizient erkannt wird. Dies resultiert in einer vermehrten
Akkumulation von korrekt 3'End-prozessierter mRNA im Zytoplasma, die in
Protein translatiert werden kann. Diese erhöhte Effizienz der 3'End-
Prozessierung stellt einen neuartigen molekularen Mechanismus einer
hereditären Erkrankung dar und erklärt die Rolle der Prothrombin 20210 G>A
Mutation bei der Pathogenese von Thrombosen. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit
eindrücklich wie bereits eine nur geringe Abweichung der mRNA-Prozessierung
für eine verbreitete und gefährliche Krankheit prädisponieren kann. Im zweiten
Teil wurde der Nonsens-vermittelte mRNA-Abbau (NMD), ein hoch-konservierter
Mechanismus der posttranskriptionalen mRNA-Qualitäts-kontrolle untersucht.
Dieser Mechanismus, der zum raschen Abbau von Nonsens-mutierten mRNAs führt,
spielt als modifizierender Faktor eine wichtige Rolle bei zahlreichen
hereditären Erkrankungen. Besonders gut belegt ist dieser Effekt des NMD bei
Nonsens-Mutationen des β-Globins die zur β-Thalassämie führen. Das β-Globin-
Gen diente auch in dieser Arbeit zur Analyse von funktionellen Charakteristika
des NMD. Untersuchungen zur Rolle des Poly(A)-Schwanzes beim NMD zeigten
eindeutig, daß der humane NMD poly(A)-unabhängig stattfindet. Weiterhin wurde
ein experimentelles System entwickelt um Faktoren des humanen NMD zu
identifizieren und charakterisieren. Diverse Deletions-mutanten des humanen
NMD-Faktors hUpf3b wurden in diesem System auf ihre NMD-Aktivierung
untersucht. Es zeigte sich, daß eine Region, die nachfolgend als Y14
Bindungsstelle identifiziert wurde, eine essentielle Rolle für die NMD-
Funktion von hUpf3b spielt. Dies implizierte eine Funktion von Y14 beim NMD.
Daher wurde die Wirkung von Y14 im experimentellen System untersucht, was zu
einer außergewöhnlich starken Aktivierung des NMD führte. Zusammen definieren
diese Experimente also eine wichtige Rolle von Y14 beim humanen NMD. Die durch
diese Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Veränderung der Genexpression bei
hereditären Erkrankungen liefern einen wichtigen Beitrag zum generellen
Verständnis von Auswirkungen krankheitsverursachender Mutationen auf Schritte
des mRNA-Stoffwechsels. Zusätzlich werden die Ergebnisse einen wesentlichen
Einfluß auf zukünftige Untersuchungen der molekularen Pathogenese
verschiedener Erbkrankheiten ausüben.
de
dc.description.abstract
Disease-causing mutations are commonly located within the open reading frames
of mRNAs and are likely to affect the protein structure and function. However,
several hereditary diseases do not result from mutations which exert these
obvious effects, but have been shown to influence various steps of mRNA
metabolism. In this study two examples of disease-producing mutations have
been used to investigate post-transcriptional mechanisms affecting gene
expression. In the first part of this thesis, the molecular mechanism
underlying the prothrombin 20210 G>A mutation has been elucidated. This
mutation represents a very common genetic risk factor for the occurrence of
thromboses and affects 1-2% of the European population. The G>A transition is
located at the last nucleotide of the 3'UTR of the mRNA and causes elevated
prothrombin plasma levels, which are thought to play an important role in the
pathogenesis of the disease. Here I show, that the normal prothrombin 3'end
processing signal is inefficiently recognised and that the G>A transition is a
gain of function mutation causing an increase of processing site usage. This
results in an elevation of correctly 3'end processed mRNA accumulation in the
cytoplasm and increased protein synthesis. Enhanced mRNA 3?end formation
efficiency emerges as a novel molecular principle causing a hereditary disease
and explains the role of the prothrombin 20210 G>A mutation in the
pathogenesis of thrombosis. Furthermore this work also represents a striking
example of how a quantitatively minor aberration of mRNA processing can
predispose to a common and serious disease. A highly conserved mRNA quality-
control mechanism referred to as nonsense-mediated mRNA decay has been
investigated in the second part of this thesis. This mechanism, which leads to
the rapid degradation of nonsense-mutated mRNA, plays an important role as a
modifying factor in a number of hereditary diseases. The important role of the
NMD-pathway is exemplified by mutations in the β-globin gene, leading to
β-thalassemia. The β-globin gene was also used in this study to analyse
functional characteristics of the NMD. Experiments adressing the role of the
poly(A) tail for the NMD-pathway showed, that human NMD occurs poly(A)
independent. Furthermore, an experimental system has been developed to
identify and characterise protein factors involved in human NMD. A number of
deletion mutants of the human NMD-factor hUpf3b were created and tested for
their ability to elicit NMD in this system. This approach showed that a
sequence, subsequently identified as Y14 interaction site, played an essential
role for the NMD-activation by hUpf3b. This indicated an NMD function of Y14.
In further experiments, direct analysis of Y14 resulted in a dramatic NMD-
activation. Together, these experiments define an important role of Y14 in the
human NMD-pathway. In summary, these results provide an important contribution
to our general understanding of effects of disease-causing mutations on
various steps of the mRNA-metabolism. Furthermore they will have a remarkable
impact on future investigations of the molecular pathogenesis of hereditary
diseases.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
gene expression
dc.subject
hereditary disease
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Posttranskriptionale Veränderungen der Genexpression bei hereditären
Erkrankungen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Andreas Kulozik
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Volker Erdmann
dc.date.accepted
2002-10-24
dc.date.embargoEnd
2002-11-26
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002485
dc.title.translated
Posttranscriptional changes of gene expression in hereditary diseases
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000778
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/248/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000778
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access