The urine proteome of kidney transplant patients: a new approach for the identification of non-invasive rejection markers

Abstract

Kidney transplantation is nowadays the established therapy of end-stage renal disease. Due to tissue incompatibilities between donor organ and recipient, a lifelong immunosuppression with a broad range of side-effects is inevitable after transplantation. However, immunosup- pressive agents are the only option to control humorally and cellularly mediated rejections. Despite matching of histocompatibility and the application of immunosuppressants, the inci- dence of acute rejection episodes is still high. Infiltration of the donor organ with alloreactive leucocytes leads to the destruction of transplant tissue and compromises long-term graft sur- vival. For those reasons, accurate and timely diagnosis of acute rejection, even if subclinical, is essential. Gold standard for diagnosis of acute rejections is the histopathological examina- tion of allograft tissue, which requires a needle biopsy of the organ. The invasive procedure of needle biopsies implies the risk of complications and is not suitable for routine examina- tions. Measuring of serum creatinine levels as an indicator of renal function allows a close monitoring, but is neither sensitive nor specific for rejections. Serum creatinine levels will not rise until the allograft is already damaged, and incipient rejections and the adequate therapy might be missed. Urine is an obvious source of material for the identification of specific and sensitive rejection markers and the development of new diagnostic tests. Its non-invasive obtainability in suffi- cient amounts, and anatomical proximity to the kidneys raise the probability that alterations in its composition can be detected during episodes of rejection. New proteomic techniques allow the high-resolution separation of proteins and the simultaneous detection of diverse changes in protein expressions. In this study, we used 2-dimensional electrophoresis com- bined with mass spectrometry to define the urine proteome of renal transplant patients and to identify differentially expressed proteins during episodes of acute rejection. A total of 178 unique proteins was identified and 17 of them were defined as high-abundance. Among the differentially expressed proteins in rejecting patients we found osteopontin, β2-microglobulin and Hsp71. Osteopontin was evaluated quantitatively in free urine by immunoassay.

Die Nierentransplantation ist mittlerweile Methode der Wahl zur Therapie der terminalen Niereninsuffizienz. Aufgrund der Gewebeunverträglichkeit von Spenderorgan und Empfänger ist postoperativ eine lebenslange Immunsuppression unumgänglich, die jedoch ein breites Spektrum an Nebenwirkungen hervorrufen kann. Trotzdem bietet nur die Gabe von Im- munsuppressiva die Möglichkeit, humoral und zellulär vermittelte Abstoßungsreaktionen zu kontrollieren. Trotz der Anpassung von Histokompatibilitätskomplex-Spezifitäten von Spender und Empfänger und der Gabe von immunsuppressiven Therapeutika kommt es im- mer noch häufig zum Auftreten von akuten Abstoßungen. Die Infiltration des Organs durch immunkompetente Zellen des Empfängers führt zur Schädigung des Transplantatgewebes und zu einer eingeschränkten Langzeitfunktion. Deshalb ist die rechtzeitige und sichere Di- agnose der Abstoßungsreaktion notwendig, auch wenn diese sich noch nicht klinisch zeigt. Der Goldstandart zur Diagnose einer akuten Abstoßung nach Nierentransplantation ist die histopathologische Untersuchung von Transplantatgewebe, welches durch eine Nadelbiopsie gewonnen wird. Dieser invasive Eingriff ist mit gewissen Risiken für den Patienten verbunden und kann nicht mehrfach innerhalb kurzer Zeit durchgeführt werden. Der Serumkreatinin- spiegel als Indikator der Nierenfunktion erlaubt ein tägliches Monitoring, ist aber weder sen- sitiv noch spezifisch für Abstoßungsreaktionen - subklinische Abstoßungen können dadurch lange übersehen werden und unbehandelt bleiben. Der Serumkreatininspiegel steigt zudem erst bei fortgeschrittener Schädigung des Transplantats, sodass eine beginnende Abstoßung nicht erkannt und deren adäquate Therapie verzögert werden kann. In der Entwicklung diagnostischer Tests bietet sich Urin als Materialquelle zur Identifika- tion von sensitiven und spezifischen Abstoßungsmarkern an. Urin kann in ausreichenden Mengen und nicht-invasiv gewonnen werden. Die anatomische Nähe zu den Nieren erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass während einer Abstoßungsreaktion Veränderungen in seiner Zusammensetzung gefunden werden können. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, dass die Hochregulation der mRNA von Granulysin und IP-10 im Urinsediment prädiktiv für akute Abstoßungen ist. Fortschritte im Bereich der Proteomics erlauben heute die hochau- flösende Auftrennung hochkomplexer Proteingemische und die Erfassung von dynamischen Veränderungen der Proteinexpression. In der vorliegenden Studie nutzten wir 2-D Gelelek- trophorese in Kombination mit Massenspektrometrie zur Identifikation der im Urin gelösten Proteine und erfassten die Veränderung ihrer Expression während einer Abstoßungsreaktion gegen das Transplantat. Dabei wurden 178 einzelne Proteine identifiziert, 17 von ihnen wur- den als “Hauptproteine” definiert. Es zeigte sich, dass u.a. Osteopontin, β2-Mikroglobulin und Hsp71 während einer Abstoßungsepisode unterschiedlich zu stabilen Verläufen exprim- iert wurden. Auch im freien Urin konnte mittels ELISA eine erhöhte Osteopontin Proteinkonzentration bei Patienten mit Abstoßungsreaktionen festgestellt werden.