Visualization of cell death after experimental stroke in the mouse

Abstract

Introduction: Cell death is one of the pathophysiological hallmarks after stroke. Markers to image death of brain cells in vivo are highly desirable. One of the candidate targets is phosphatidylserine (PS). Where-as PS is usually located on the inner leaflet of the plasma membrane bilayer facing the cytosol, it is translocated to the surface of the cell during cell death. This makes PS accessible for markers based on Annexin A5 (AnxA5) characterized by a high affinity and specific binding to PS. The aim of this thesis was to investigate whether AnxA5 can be used to specifically visualize cell death of brain cells after ex-perimental stroke. Methodology: In this thesis, AnxA5 was explored using three different approaches. First, we investigat-ed a fluorescently labeled AnxA5 for in vivo and ex vivo near-infrared fluorescence imaging in experi-mental stroke in the mouse. We compared it to a non-binding control of AnxA5 and to other established cell death markers. In the second study, we evaluated a dual-labeled AnxA5 in the same animal model using single-photon emission computed tomography (SPECT), ex vivo activity measurements, and auto-radiography. As a positive control, we used ethanol- induced cell death in the femur muscle. In the third study, we developed a long-circulating version of AnxA5, called XTEN-AnxA5. We examined its binding affinity using camptothecin-induced cell death in Jurkat T cells and specific accumulation inside chemo-therapy-induced cell death in tumors. Results: We showed that fluorescently labeled AnxA5 can be used to visualize cell death after experi-mental stroke in vivo. Only for functional, but not for non- binding AnxA5 control, increased signal intensi-ties in the ipsilateral compared with contralateral hemisphere were found. AnxA5 specifically bound to dead or dying cells as confirmed by immunohistochemistry where the vast majority of cells were also positive for other cell death markers. However, we did not detect dual-labeled AnxA5 in the brain using SPECT, whereas it was observed in ethanol-induced cell death in the femur muscle. Our newly devel- oped long-circulating XTEN-AnxA5 prolonged blood half-life to about 1 h and improved further imaging properties. We showed that XTEN-AnxA5 bound specifically to dead or dying cells in culture and dis-played an increased accumulation inside the tumors compared to wild-type AnxA5. Conclusions: Whereas AnxA5 seems to bind specifically to dead or dying cells, its applicability for brain imaging needs to be further investigated using compounds designed to overcome the blood-brain barrier and reach their target.

Einleitung: Zelltod ist eines der pathophysiologischen Ereignisse nach Schlaganfall. Aus diesem Grund ist es erstrebenswert, Marker zur Bildgebung von Zelltod in vivo zu finden. Als mögliches Target kommt Phosphatidylserine (PS) in Frage. Während sich PS in gesunden Zellen auf der Innenseite der Plasma-membran dem Zytosol zugewandt befindet, wird es auf die Zelloberfläche transloziert, sobald eine Zelle stirbt. Auf diese Weise wird PS für Annexin A5 (AnxA5)-basierte Marker zugänglich, die dieses mit hoher Affinität und Spezifität binden. Ziel dieser Doktorarbeit war es, zu untersuchen, ob AnxA5 zur spezifi-schen Bildgebung von Zelltod nach experimentellem Schlaganfall eingesetzt werden kann. Methodik: In dieser Arbeit wurde AnxA5 in drei verschiedenen Studien erforscht. In der ersten Studie untersuchten wir ein fluoreszenz-markiertes AnxA5 zur In-vivo- und Ex-vivo-Nah-Infrarot- Fluoreszenzbildgebung im Schlaganfallmodell der Maus. Dazu verglichen wir es mit einer nicht-bindenden AnxA5-Kontrollsubstanz und anderen etablierten Zelltodmarkern. In der zweiten Studie evaluierten wir ein zweifach markiertes AnxA5 im gleichen Tiermodell unter Verwendung von Einzelphotonen- Emissionscomputertomographie (SPECT), Ex-vivo-Aktivitätsmessungen und Autoradiographie. Zur Posi-tivkontrolle diente Äthanol-induzierter Zelltod im Oberschenkelmuskel. Schließlich entwickelten wir in der dritten Studie ein lang zirkulierendes AnxA5, das so genannte XTEN-AnxA5. Wir untersuchten seine Bin-dungsaffinität mittels Camptothecin induziertem Zelltod in Jurkat-T-Zellen und die spezifische Anreiche-rung des Moleküls in Tumoren nach durch Chemotherapie induziertem Zelltod. Ergebnisse: Wir konnten nachweisen, dass fluoreszenz-markiertes AnxA5 nach experimentellem Schlaganfall zur In-vivo- Zelltodbildgebung verwendet werden kann. Nur bei funktionellem, aber nicht bei der nicht-bindendem AnxA5-Kontrolle, konnten erhöhte Signalintensitäten in der geschädigten im Ver-gleich zur nicht geschädigten Gehirnhälfte gefunden werden. Tote oder sterbende Zellen wurden spezi-fisch von AnxA5 gebunden, was durch Immunhistochemie bestätigt wurde, wobei auch andere Zelltod-marker die Mehrzahl dieser Zellen markierten. Jedoch waren wir nicht in der Lage mit SPECT zweifach markiertes AnxA5 im Schlaganfall festzustellen, wohingegen es bei Äthanol-induziertem Zelltod im Ober-schenkelmuskel nachgewiesen werden konnte. Unser neu entwickeltes lang zirkulierendes XTEN-AnxA5 verlängerte die Bluthalbwertzeit auf etwa eine Stunde und verbesserte weitere Bildgebungseigenschaften. Tote oder sterbende Zellen in Kultur wurden spezifisch von XTEN-AnxA5 gebunden und wir erreichten eine stärkere Anreicherung von XTEN-AnxA5 im Vergleich zu Wildtyp-AnxA5 in Tumoren. Schlussfolgerung: Während AnxA5 scheinbar spezifisch an tote oder sterbende Zellen bindet, muss seine Eignung für Bildgebung im Gehirn unter Verwendung von Substanzen, die so ausgelegt sind, die Bluthirnschranke zu überwinden und das Zielmolekül zu erreichen, weiter untersucht werden.