Disease-related posttranscriptional modifications of glycine receptor mRNA under physiological and pathophysiological conditions

Abstract

Inhibition is crucial for control of hippocampal network activity, and deregulated inhibition is associated with TLE. GlyR were suggested to contribute to hippocampal tonic inhibition, but the molecular and cellular requirements for such a role are controversial or unknown. On the one hand, the affinity of GlyR is too low for a response to hippocampal ambient glycine; on the other hand, their (sub)-cellular localization in the hippocampus is totally unknown. The distribution of hippocampal GlyR was therefore investigated first, and it was found that the long splice variant α3L is the predominant one in mouse hippocampus and the majority of TLE patients. In a subset of TLE patients with a high degree of hippocampal cell loss GlyRα3L and β expression was decreased. This supports preferential GlyRα3L immunoreactivity observed in mouse dentate gyrus and Cornu Ammonis regions because TLE-associated hippocampal cell loss mostly concerns principal cell layers. In addition, GlyRα3L immunoreactive signals were clustered (independently of GlyRβ and gephyrin), and GlyRα3L clusters were present mostly at non-synaptic sites; thus fulfilling the first requirement for their involvement in tonic inhibition. The second requirement for tonic inhibition is the presence of GlyR with a high affinity to glycine. In fact, the recently discovered RNA-edited GlyR could fulfill this task as their affinity approximates hippocampal ambient glycine, but their expression in humans was not investigated. The second major finding of this study therefore is the detection of edited GlyRα2 and α3 mRNA in the hippocampus of TLE patients. Thus, GlyR RNA editing is both a cross-subunit and a cross-species posttranscriptional mechanism for modulation of receptor agonist affinity. That expression of high affinity GlyR (either produced by RNA editing or by alternative splicing, i.e. GlyRα2B) was found to be increased in TLE patients with a high degree of hippocampal damage suggested a pathophysiological role of GlyR posttranscriptional processing. Analysis of RNA-edited GlyRα3 at a cellular level in primary hippocampal neurons indeed corroborated this theory because neurons expressing the high affinity receptor variant resembled TLE histopathology. In detail, these neurons exhibited abnormal dendrite morphology and upregulated Glu/GABA ratios of synaptic input; the latter resulting from loss of GABAergic synaptic contacts and increased glutamatergic innervation. Consequently, they were more susceptible to excitotoxicity. The last major result of this study is the finding that restoration of a "physiological" chloride equilibrium potential by KCC2 expression is neuroprotective. Prevention of KCC2 downregulation in TLE hippocampus could therefore open avenues for new therapeutic strategies. Altogether, GlyR posttranscriptional mechanisms were identified as homeostatic, but pathophysiological, executive cellular processes within a deregulated neuronal network.

Neuronale Hemmung trägt wesentlich zur Kontrolle der Netzwerkaktivität im Hippocampus bei. Eine deregulierte Hemmung wird oft als ursächlich für TLE angesehen. GlyR wurden bereits hinsichtlich ihrer Beteilgung an hippocampaler tonischer Hemmung diskutiert; allerdings sind die zellulären und molekularen Voraussetzungen für eine solche Aufgabe unbekannt, denn die Affinität der Rezeptoren reicht für eine Antwort auf hippocampales Umgebungsglycin nicht aus. Zudem ist die (sub)zelluläre Verteilung der Rezeptoren im Hippocampus gänzlich unbekannt. Aus diesem Grund wurde zuerst die GlyR-Verteilung mittels Immunhistochemie im Hippocampus der Maus ermittelt. Sowohl im Maus-Hippocampus als auch bei der Mehrheit der TLE Patienten wurde die lange Spleißvariante α3L als die majoritäre Rezeptorform identifiziert. Bei Patienten mit ausgeprägten Gewebeschädigungen war die α3L-Expression (zusammen mit GlyRβ) verringert. Da Prinzipalzellschichten hauptsächlich von Gewebeschädigungen betroffen sind, bekräftigt dieser Befund die immunhistochemische Lokalisierung von α3L in Prinzipalzellschichten (Gyrus dentatus und Cornu Ammonis) des Maus- Hippocampus. Zudem wurde die α3L-Immunreaktivität in Aggregatform festgestellt, die ohne GlyRβ und Gephyrin zustande kommt. GlyRα3L-Aggregate waren größtenteils an nicht-synaptischen Stellen der Plasmamembran lokalisiert, wodurch die erste Voraussetzung zur Vermittlung von tonischer Hemmung erfüllt ist. Die zweite Voraussetzung für eine Beteiligung von GlyR an tonischer hippocampaler Hemmung betrifft die Affinität der Rezeptoren. Die neuerdings entdeckten RNA-editierten Rezeptoren wären dafür sehr gut geeignet, denn ihre Affinität entspricht annähernd dem hippocampalen Umgebungsglycin. Das zweite hervorzuhebende Ergebnis dieser Arbeit ist demnach der Nachweis von editierten GLRA2- und GLRA3-Transkripten im Hippocampus von TLE-Patienten. RNA-Editierung findet also Spezies- und Untereinheiten-übergreifend statt. Interessanterweise war die Expression von hochaffinen Rezeptorvarianten (entweder durch RNA-Editierung oder aber alternatives Spleißen, i.e. GlyRα2B) im Hippocampus derjenigen TLE-Patienten erhöht, bei denen der Schweregrad der Erkrankung sehr hoch war, wodurch diesen posttranskrpionalen Mechanismen eine pathophysiologische Rolle zugesprochen werden kann. Die anschließende Charakterisierung der hochaffinen Rezeptoren in neuronalen Primärkulturen aus Rattenhippocampus bekräftigte diese Annahme insofern als die Neurone verkürzte Dendriten und ein erhöhtes Glu/GABA-Verhältnis der synaptischen Eingänge aufwiesen. Letzteres erklärt sich aus dem Verlust GABAerger Synapsen begleitet von einer Hochregulierung glutamaterger synaptischer Eingänge, wodurch diese Neurone besonders empfindlich für Glutamat-Excitotoxizität wurden. Alles in allem erinnern diese Beobachtungen stark an die TLE-Histopathologie. Schließlich ist hervorzuheben, dass das Wiederherstellen eines "physiologischen" Chloridequilibriumpotentials durch KCC2-Expression neuroprotektiv wirkt. Somit eröffnet die Verhinderung der KCC2-Abregulierung in TLE-Hippocampi neue therapeutische Möglichkeiten. Zusammenfassend wurden posttranskriptionale Mechanismen an GlyR-Transkripten als homeostatische ausführende Mechanismen eines deregulierten neuronalen Netzwerks mit pathophysiologischen Konsequenzen identifiziert.