Endothelzell-Differenzierungs-Gen-Rezeptoren bei Fibroseprozessen in Herz (EDG-2) und Niere (EDG-1)

Abstract

LPA induziert Proliferation von kardialen Rattenfibroblasten, nicht aber die Kollagen-Synthese Kardiale Fibrose ist als pathophysiologischer Mechanismus an der Entstehung von Erkrankungen des menschlichen Herzens beteiligt. Sie wird als überproportionale Vermehrung von Matrixproteinen beschrieben. Der Einfluss von EDG-(Endothelzell-Differenzierungs-Gen)-Rezeptoren mit ihren Agonisten S1P (Sphingosin-1-phosphat) und LPA (Lysophosphatidylsäure) auf zelluläre Prozesse wie Proliferation, Migration und Wundheilung ist bekannt. Die exakte Rolle von LPA im Rahmen der Entstehung kardialer Fibrose bleibt bislang unklar. Ziel der vorgelegten Dissertation ist es, diese Rolle näher zu untersuchen. Mit Hilfe des XTT Proliferationsassays konnte gezeigt werden, dass der EDG-2 Agonist LPA proproliferativ auf kultivierte kardiale Rattenfibroblasten wirkt. Diese Wirkung führte aber nicht zu einer veränderten Genexpression von bekannten Fibrosemarkergenen wie CTGF, TGF-ß, Col I, Col III, Fibronectin und MMP-2. Für die beiden Gene MMP-9 und TIMP-2 konnte gezeigt werden, dass sie nach LPA- Stimulation vermindert exprimiert werden. Weiterhin wurden die Rezeptorproteine von EDG-1 und EDG-2 mit verschiedenen Methoden auf den Rattenfibroblasten nachgewiesen und ihre subzelluläre Lokalisation näher untersucht: EDG-1 war vor allem zytoplasmatisch lokalisiert während für EDG-2 zusätzlich ein nukleäres Vorkommen gefunden wurde. Die Frage nach dem Einfluss von LPA auf die Entstehung von kardialer Fibrose muss also differenziert betrachtet werden: LPA wirkt proliferationsfördernd auf kardiale Fibroblasten, führt in diesen aber nicht zu einer vermehrten Genexpression von bestimmten Fibrose-relevanten Genen. Für MMP-9 und TIMP-2 kann ein möglicher Einfluss auf die Zusammensetzung der EZM auf Proteinebene diskutiert werden. Um mögliche Einflüsse von LPA am EDG-2 Rezeptor auf die Entstehung von myokardialer Fibrose zu untersuchen, müssten weitere Experimente z.B. in Knock-out- Modellen, mit selektiven Antagonisten oder siRNA unternommen werden. EDG-1 Expression im Verlauf der anti-THY-1-induzierten chronisch progredienten Glomerulosklerose Die anti-THY-1-induzierte chronisch progrediente Glomerulosklerose stellt ein Modell für Fibroseprozesse der Niere dar. Der EDG-1 Agonist und Immunmodulator FTY720 wurde in Phase-II-klinischen Studien zur Reduktion von Transplantatabstoßungsreaktionen eingesetzt. Bislang wurden die Effekte von FTY720 vor allem über die immunosuppressiven Eigenschaften, d.h. einem vermehrten Sequestrieren von Lymphozyten erklärt, über eine mögliche intrarenale Wirkung als Ursache dieser Effekte bislang nicht. In einem ersten Schritt sollte in der vorliegenden Dissertation die Rolle von EDG-1 in der anti-THY-induzierten chronisch progredienten Glomerulosklerose untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Proteinexpression von EDG-1 im Verlauf der anti-THY-1-induzierten chronisch progredienten Glomerulosklerose bei steigenden Proteinuriewerten der Niere verglichen mit den nierengesunden Kontrolltieren deutliche abnimmt. Immunhistologisch waren die Veränderungen am Nierengewebe in Form von geweiteten Tubuli und Glomeruli klar zu erkennen, sowie ein basozelluläres Vorkommen von EDG-1 im distalen Tubulus mit der APAAP Methode nachzuweisen. Eine systemische Auswirkung des renalen Hypertonus auf die Struktur des Herzgewebes im Sinne einer kardialen Fibroseentwicklung konnte in Sirius-Red-Färbungen nicht nachgewiesen werden. In Zusammenhang mit den Ergebnissen aus dem akuten Modell der anti-THY-1 induzierten Glomerulosklerose wird eine Beteiligung von EDG-1 an der Entstehung dieser Fibroseform diskutiert und bietet neben Untersuchungen zum Einfluss von FTY720 auf die Rezeptorexpression zahlreiche Ansätze für weiterführende Untersuchungen.

LPA induces proliferation of cardiac fibroblasts but not collagen synthesis Cardiac fibrosis as a pathophysiological mechanism is involved in the development of cardiac diseases and is considered to be a dysproportional expansion of matrix proteins. The influence of EDG (endothelial differentiation gene cell) receptors with their agonists S1P (sphingosin-1-phosphate) and LPA (lysophosphatidic acid) on cellular mechanisms like proliferation, migration and wound healing is well described. The exact role of LPA in the development of cardiac fibrosis has been remained unclear. This medical dissertation aimed to investigate this role more closely. By means of the XTT proliferation assay we could show that the EDG-2 agonist LPA induces proliferation of cultured rat cardiac fibroblasts. This effect did not change the gene expression of fibrosis marker genes like CTGF, TGF-ß, Col I, Col III, fibronectin and MMP-2. On the other hand gene expression of MMP-9 and TIMP-2 was reduced in response to LPA stimulation. Furthermore, receptor-proteins of EDG-1 and EDG-2 were localized on rat cardiac fibroblasts by different techniques and their sub-cellular distribution was investigated more closely: EDG-1 was mainly localized in the cytoplasm whereas EDG-2 was additionally found in the nucleus. In conclusion LPA induces the proliferation of cultured cardiac fibroblasts but does not lead to increased gene expression levels of fibrosis marker genes. For MMP-9 and TIMP-2 a possible influence on the composition of extracellular matrix proteins can be discussed. In order to further investigate the role of LPA via the EDG-2 receptor for the development of cardiac fibrosis experiments could be done with knock-out-models, selective antagonists or siRNA. EDG-1 expression in the course of anti-THY-1-induced chronic progressive glomerulosclerosis Anti-THY-1-induced chronic progressive glomerulosclerosis represents a model for renal fibrosis. The EDG-1 agonist and immunomodulator FTY720 has been evaluated up to phase-III-clinical studies for reduction of transplant organ rejection. So far, effects of FTY720 have been associated with its immunosuppresive action, e.g. more sequestration of lymphocytes, but not with possible intrarenal mechanisms. In a first step, the role of EDG-1 during the anti-THY-1-induced chronic progressive glomerulosclerosis was investigated. The data demonstrate that the protein expression of EDG-1 is clearly reduced in the course of the anti-THY-1-induced chronic progressive glomerulosclerosis compared to rats with normal kidney function. Immunohistochemistry revealed changes of the renal tissue, e.g. widened tubuli and glomeruli, as well as a baso-cellular localisation of EDG-1 in the distal tubuli by means of the APAAP method. A possible systemic effect of a renal hypertonus on the cardiac tissue composition was not found in sirius-red- stainings. A possible role of EDG-1 for the development of renal fibrosis is discussed in the context of results from the model of acute anti-THY-1-induced glomerulosclerosis offering a variety of possible future experiments, e.g. evaluate the influence of FTY720 on receptor protein expression.