Regulation des epithelialen Natriumkanals der Niere (ENaC) durch Androgene

Abstract

Mit Beginn der Pubertät steigt der normale Blutdruck bei Jungen bzw. Männern stärker an als der bei Mädchen bzw. Frauen. Diese Differenz bleibt im Erwachsenenalter zunächst bestehen, bis sich schließlich die Blutdruckwerte zwischen den Geschlechtern im höheren Lebensalter wieder angleichen. In verschiedenen Rattenmodellen fielen ebenfalls geschlechtsspezifische Blutdruckunterschiede auf, welche durch Kastration der männlichen Tiere aufgehoben werden konnten. Des Weiteren ist bekannt, dass Geschlechtshormone komplexe Effekte auf das renale und kardiovaskuläre System ausüben und eine Rolle bei der Blutdruckregulation spielen. Der epitheliale Natriumkanal (ENaC) moduliert Natrium- und Wasserreabsorption in der Niere. Aldosteron ist einer der Hauptregulatoren des ENaC. Eine geschlechtsspezifische Regulation des ENaC insbesondere über Androgene war bislang nicht ausreichend untersucht. Androgene selbst wirken über den Androgen-Rezeptor (AR). Dessen Autoregulation durch Androgene ist sehr gewebsspezifisch und abhängig von der untersuchten Spezies sowie von deren Entwicklungsstadium. Gegenstand dieser Arbeit ist die Frage, ob es in vivo geschlechtsspezifische Expressionsunterschiede von ENaC und AR basal sowie nach Hormonstimulation gibt. Außerdem wurde überprüft, ob es im Promoter der untersuchten Zielproteine potentielle Regionen gibt, die eine Regulation durch Geschlechtshormone erklären. Dies erfolgte am Rattenmodell in vivo sowie in vitro an den renalen Zelllinien M1 und RCCD2 wie auch an primären Gefäßmuskelzellen der Ratte (VSMC). Dabei wurden mittels semiquantitativer und quantitativer PCR und Western Immunoblot die Expressionsniveaus aller ENaC-Untereinheiten sowie des AR auf mRNA- und Protein-Ebene untersucht. Die basale renale Expression der ENaC-Untereinheiten sowie des AR unterschied sich zwischen gonadektomierten Männchen und Weibchen nicht. Die Behandlung der männlichen Ratten mit Testosteron 500 mg/kg KG (TUD500) führte zu einer moderaten Heraufregulation von alpha-ENaC mRNA. Ebenso war alpha-ENaC Protein nach Behandlung der Männchen mit Testosteron oder 5alpha-Dihydrotestosteron (DHT) heraufreguliert. Die Expression von beta- und gamma-ENaC war bei männlichen Ratten durch Androgene unbeeinflusst, es zeigten sich keine quantitativen Unterschiede von mRNA oder Protein in PCR oder Western Blot im Vergleich zu gonadektomierten männlichen Kontrolltieren. Im Gegensatz zu den männlichen Tieren zeigte sich bei weiblichen Wistar-Ratten eine Herunterregulation der mRNA-Expression aller ENaC-Untereinheiten durch Androgene im Vergleich zu ovariektomierten weiblichen Kontrolltieren. Dieser Effekt war signifikant nach Behandlung der Weibchen mit DHT. Die Western Blots für alpha-und beta-ENaC Protein konnten diesen Effekt bei den weiblichen Tieren bestätigen, während die Expression von gamma-ENaC Protein insgesamt sehr gering war. In gleicher Art und Weise ergaben sich geschlechtsspezifische Unterschiede in der Autoregulation des AR. Die Gabe von TUD500 führte zu einer signifikant stärkeren Expression von renaler AR mRNA und AR Protein bei männlichen Wistar-Ratten. Im Western Blot zeigte sich zudem eine erhöhte Expression von AR Protein nach DHT Behandlung bei den Männchen. Im Gegensatz dazu bestand bei weiblichen Wistar-Ratten eher ein Trend in Richtung Suppression von AR mRNA und Protein im Vergleich zu weiblichen Kontrolltieren. Estradiol (E2) führte schließlich zu einer signifikanten Herunterregulation von AR mRNA. Die in dieser Arbeit genutzten Zelllinien zeigten diverse Einschränkungen, die eine Untersuchung der Androgen-abhängigen Regulation des ENaC in vitro sehr erschwerte. Die renale Zelllinie M1 exprimiert zwar alle Untereinheiten des ENaC, hat allerdings ihre physiologische Antwort auf Aldosteron-Stimulation bereits verloren und stellt mangels Expression des AR kein optimales Modell zur Untersuchung geschlechtsspezifischer Mechanismen der ENaC-Regulation dar. Die renale Sammelrohr-Zelllinie RCCD2 exprimiert ebenfalls alle drei ENaC-Untereinheiten und zeigt im Gegensatz zu M1 eine Aldosteron- und MR-abhängige Stimulation von alpha-ENaC. Dennoch wird auch auf RCCD2-Zellen AR Protein nicht ausreichend exprimiert, so dass eine Behandlung mit Androgenen bei diesen Zellen ebenfalls keinen Einfluss auf die Expression von ENaC mRNA hatte. Da bekannt ist, dass der AR auf glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) exprimiert wird, wurden diese zusätzlich hinsichtlich der Expression von ENaC und dessen Regulation untersucht. VSMC zeigte lediglich eine Expression von alpha-ENaC, wobei sich auch hier keine Regulation durch Androgene fand. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ENaC und AR geschlechtsspezifisch durch Androgene reguliert werden. Obgleich die in dieser Arbeit beschriebenen Expressionsunterschiede signifikant, aber relativ gering sind, könnten Androgene auf diese Weise in der Lage sein, die renale Natriumreabsorption zu beeinflussen und sich somit auf den Blutdruck auszuwirken. Dies würde eine mögliche Erklärung für die beobachtbaren physiologischen Blutdruckunterschiede zwischen den Geschlechtern liefern.

With the beginning of puberty blood pressure increases more in men than in women. This difference persists in adulthood until blood pressure finally becomes equal between men and women in the elderly population. Sex-differences in blood pressure have been shown to exist in different rat models, as well. Interestingly, castration of the males abolished the difference in blood pressure. It is well known that sex hormones have complex effects on the renal and cardiovascular system and that they play an important role in blood pressure regulation. The epithelial sodium channel consists of three subunits and modulates sodium and water reabsorption in the kidney. Aldosterone is one of ENaC’s main regulators. So far a possible sex-specific regulation of ENaC, especially by androgens has not been investigated in detail. Androgens bind to the androgen receptor (AR). Its autoregulation by androgens is tissue-specific and depends on the studied species and their age. The aim of this work was to determine sex-dependent differences in ENaC and AR expression in vivo in baseline and after hormone treatment. In addition, the promoter region of the target genes were analyzed for potential binding sites that may explain a regulation by sex hormones. Therefore, an in vivo rat model was used and in vitro experiments with the renal cell lines M1 and RCCD2 as well as with primary vascular smooth muscle cells of the rat (VSMC) were performed. mRNA and protein expression levels of ENaC subunits and AR were analyzed by using semiquantitative and quantitative PCR and Western immunoblot. Gonadectomized male and female Wistar rats showed no difference in baseline expression of renal ENaC subunits or AR. Treatment of male rats with testosterone 500 mg/kg body weight (TUD500) led to a moderate upregulation of alpha-ENaC mRNA. Similarly, alpha-ENaC protein expression was elevated in males that had been treated with testosterone or 5alpha-dihydrotestosterone (DHT). The expression of beta- and gamma-ENaC was not influenced by androgen treatment in male rats. There was no change in mRNA or protein expression compared to gonadectomized male control animals. In contrast to males, androgens downregulated mRNA expression of all ENaC subunits in ovariectomized females. This effect was significant after treatment of the females with DHT. Western immunoblot for alpha- and beta-ENaC protein confirmed this observation in female animals, while expression of gamma-ENaC protein was overall very low. Similarly, sex- specific differences in autoregulation of the renal AR were observed. Treatment with TUD500 led to a significantly enhanced expression of renal AR mRNA and AR protein in male Wistar rats. In addition, in Western immunoblot an increased expression of AR protein could be seen after treatment of male rats with DHT. In contrast, there was a trend towards suppression of AR mRNA and protein by androgens in female rats compared to female control animals. Estradiol (E2) led to a significant suppression of AR mRNA. The cell lines that have been used in this work revealed several characteristics that limited an investigation of an androgen-dependent regulation of ENaC in vitro. The renal cell line M1 expresses all subunits of ENaC, but lost its physiological response to aldosterone-stimulation. Since it also lacks the AR it is no optimal model for studying sex-specific mechanisms in ENaC-regulation. The renal collecting duct cell line RCCD2 also expresses all subunits of ENaC, but in contrast to M1 shows an aldosterone- and MR-dependent stimulation of alpha- ENaC. However, AR protein is not expressed on RCCD2-cells sufficiently. Therefore, androgen treatment of these cells had no effect on expression of ENaC mRNA. As it is known that the AR is expressed on vascular smooth muscle cells (VSMC), these cells were studied for expression of ENaC and its regulation. VSMC showed only an expression of alpha-ENaC, and a regulation by androgens could not be seen. In sum, ENaC and AR seem to be regulated by androgens in a sex-specific manner. The expression differences between males and females are small, yet significant. By these means androgens might influence sodium reabsorption and therefore blood pressure. This could be a possible mechanism for determining physiological differences in blood pressure observed between men and women.