Die α-Protocadherine gehören zu der Familie der geclusterten Protocadherine, die sich aufgrund auffälliger Strukturmerkmale klar von anderen Cadherin- Familien abgrenzen. Im Gegensatz zu klassischen Cadherinen besitzen sie sechs anstelle von fünf Cadherin-Homologiedomänen, eine transmembranäre Domäne und einen zytoplasmatischen Bereich, der keine Homologien zu dem anderer Cadherine aufweist. Die ungewöhnliche Anordnung der α-, β- und γ-Protocadherine in Form von Genclustern erinnert an die genomische Organisation der Immunglobuline bzw. T-Zell-Rezeptoren. Es wird davon ausgegangen, dass sich durch alternative Promotorwahl im Falle des α-Clusters 14 verschiedene primäre Transkripte aus den hintereinander aufgereihten „variablen“ Exons ergeben, die durch cis- Spleißen mit den drei am Ende des Clusters gelegenen „konstante“ Exons verbunden werden (Kemler, 2001). Diese Anordnung sowie die große Vielfalt der geclusterten Pcdh mit weit über 50 Mitglieder und ihre Expression im zentralen Nervensystem lassen eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Gehirns und der Ausbildung neuronaler Verschaltungen vermuten. Die geclusterten Pcdh sind jedoch funktionell noch unzureichend charakterisiert; bisherige Studien führten teilweise zu widersprüchlichen Ergebnissen. Um genauere Erkenntnisse über die Funktionsweise der Protocadherine zu gewinnen, ist die Identifizierung ihrer zellulären Interaktionspartner enorm wichtig. In dieser Arbeit wurde die intrazelluläre Domäne der α-Protocadherine im Hinblick auf ihre mögliche Interaktion mit zytoplasmatischen Proteinen untersucht, um daraus Hinweise auf die Beteiligung der α-Protocadherine an der Regulierung zellulärer Funktionen ableiten zu können. Besonders im Hinblick auf die Embryogenese sind konservierte Signaltransduktionswege und die Prozesse der Zelladhäsion von fundamentaler Bedeutung. Zur Realisierung dieses Vorhabens wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System angewendet. Es wurden zunächst die cDNAs mehrerer α-Protocadherine der Maus kloniert. Die zytoplasmatische Domäne eines spezifischen Protocadherins, Pcdh α7, wurde im nächsten Schritt dafür eingesetzt, drei Hefe-Zwei-Hybrid-Bait-Vektoren herzustellen, die den variablen Bereich, den konstanten Bereich oder die gesamte zytoplasmatische Domäne beinhalten. Aus der cDNA des Gehirns einer knapp 2 Wochen alten Maus wurde eine cDNA-Bank in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Prey-Vektor hergestellt und diese nach Durchführung der erforderlichen Kontrollen zur Suche nach Interaktionspartnern des murinen α7-Protocadherin eingesetzt. Aus 1,6 x 10^6 Klonen wurden initial durch eine erste Selektion (HIS3+, ADE2+) insgesamt 283 Klone identifiziert, die mit der gesamten zytoplasmatischen Domäne des Pcdh α7 interagieren (CPvc-Screen), und 162 Klone aus 1,4 x 10^6, die speziell mit dem variablen Bereich der zytoplasmatischen Domäne interagieren (CPv-Screen). Die möglichen Interaktionspartner wurden durch die Untersuchung der Aktivierung eines weiteren Reportergenes (MEL1) auf 20 Klone des CPvc-Screen und 11 Klone des CPv-Screen eingeschränkt. Diese Klone wurden sequenziert, mit bekannten mRNA-Sequenzen der Maus verglichen und einem Rescreen unterzogen. Letztlich bestätigten sich vier positive Klone des CPvc-Screen, die jedoch alle Abschnitte der gleichen, bislang unbekannten cDNA enthielten. Das in dieser Arbeit gefundene hypothetische Protein wird derzeit in Anschlussarbeiten weiter charakterisiert, wobei verschiedene Methoden (Co-Lokalisation in der Immunfluoreszenzmikroskopie, Co-Immunpräzipitation, Bindungsassays, etc.) zur Anwendung kommen werden. Ebenfalls weiter gearbeitet werden kann mit der in dieser Arbeit vollständig klonierten Protocadherinen α1, α4, α7, α8 und α12.
The α-Protocadherins, the members of the clustered protocadherins, exhibit distinct structural features which make them unique within the cadherin superfamily. In contrast to classical cadherins, they have six instead of five extracellular cadherin repeats and a cytoplasmic domain which no homolgie to the cytoplasmic domain of other cadherins. The clustered Protocadherins are arranged in three neighboring gene clusters. The most striking feature of these clusters is a highly specific arrangement of variable and constant regions resembling distantly to the immunoglobulin and T-cell gene clusters. However, genomic recombination has been ruled out and it appears that every neuron expresses just one variable region that is spliced – in case of α- and γ-Pcdh – to the constant region made from three exons. Due to this organization and to their highly specific expression in the central nervous system, protocadherins are believed to play an important role in CNS differentiation and neural circuitry programming. They are thought to perform their function by recognizing appropiate partners on opposing surfaces and transmitting this information either through a cytoskeletal link or through a signal transduction cascade. However, still little is known about their cellular function and their cytoplasmic binding partners. In this thesis the cytoplasmic domain of α-Protocadherins has been chosen to find potential intracellular binding partners by using the Yeast-Two-Hybrid-System. A number of murine Pcdh α cDNAs were cloned and Pcdh α7 was chosen to construct three different Yeast Two-Hybrid bait vectors encompassing either the variable part of the cytoplasmic domain (CPv), or the constant domain (CPc), or both (CPvc). Whole brain mRNA of a 2 week old mouse was used to build a prey library. Whereas the CPc bait was interacting with all prey constructs, including the empty vector, without being truly autoactivating, the other CPv and CPvc baits yielded in the initial screen 162 (out of 1.4 x 10^6 sucessfully mated cells) and 283 (out of 1.6 x 10^6 sucessfully mated cells) interacting clones, respectively (HIS3+, ADE2+). All 162 positive clones of the initial CPv and 283 of the CPvc screen were analyzed individually for the expression of the third selection marker Mel1, encoding α-galactosidase. Under this more stringent selection only 11 clones stained positive of the CPv and 20 of the CPvc screen. From those 31 yeast clones, the cDNA inserts were bidirectionally sequenced and submitted to a BLAST analysis. Four sequences referred to known proteins but were in the wrong reading frame or reverse orientation, eight sequences corresponded to typical false positive matches, like ribosomal proteins, seven exhibited no similarity to any listed transcript and 12 yielded matches to a total of 6 different promising candidate proteins that are further analysed.
