Hepatitis-C-Virus-Pseudotypen und deren Einsetzbarkeit in der virologischen Diagnostik

Abstract

Hepatitisviren B und C stellen weltweit ein erhebliches medizinisches Problem und eine Bedrohung der Weltgesundheit dar. Insbesondere die Infektion mit HCV ist in der ganzen Welt eine der häufigsten Ursachen für chronische Lebererkrankungen. Der Erfolg der zumeist einjährigen Therapie mit PEG IFN und dem Nukleosidanalogon Ribavirin hängt von verschiedenen bisher noch unzureichend erforschten Faktoren (z. B. von dem infizierenden HCV-Genotyp) ab. Die Erforschung des HCV war erschwert durch den Fakt, dass es lange Zeit nicht möglich war HCV in ausreichender Menge und stabil in der Zellkultur anzuzüchten. Um die dadurch bedingten Schwierigkeiten zu umgehen, wurden HCV pseudotypisierte Viren (HCVpp) entwickelt. Sie bieten die Möglichkeit, die funktionelle und infektiöse Form von HCV zu untersuchen, da sie diese imitieren und für bestimmte Zielzellen infektiös sind. Mithilfe dieser HCVpp wurde in vorliegender Arbeit ein Neutralisationstest etabliert. Es wurden definierte Kontrollseren und Seren von Patienten, die an einer Therapiestudie teilgenommen hatten, auf ihre Neutralisationsfähigkeit untersucht. Die HCVpp, die für die Versuche verwendet wurden, tragen E1 und E2 HCV Genotyp 1a Hüllproteine auf retroviralen oder lentiviralen Corepartikeln und sind mit einem GFP-Markergen ausgestattet, welches leicht mittels durchflusszytometrischer Technik (FACS) detektierbar ist. In vorliegender Arbeit wurden diese HCVpp, mit HCV 1a Hüllglykoproteinen, als Basis für den Neutralisationstest eingesetzt. Zu Beginn musste das Testsystem etabliert und optimiert werden, um festzustellen, ob HCVpp überhaupt als verlässliches Neutralisationstest-Medium eingesetzt werden können. Hierzu wurden Versuche mit unterschiedlichen Vektoren, Zellkulturmedien und Polybrene, als Transfektionsverstärker, durchgeführt. Es zeigte sich, dass HCVpp mit lentiviralen Corepartikeln als Vektor und mit hochwertigen Nährmedien hergestellt, die besten Ergebnisse in der Höhe der infektiösen Partikelzahlen ergaben. Außerdem konnten diese durch den Zusatz von PB ebenfalls verbessert werden. Zusätzlich wurden Zelltropismusstudien mit verschiedenen B-Suspensionszelllinien und HCVpp ausgeführt, jedoch war keine der untersuchten Zelllinien für eine Infektion mit HCVpp empfänglich und daher nicht für den Neutralisationstest einzusetzen. Nach der Optimierung der HCVpp wurden Neutralisationsversuche mit verschiedenen Patientenseren durchgeführt. Diese stammten von nicht HCV-infizierten Patienten, von Patienten, deren HCV- Screening Ergebnisse uneindeutig waren, von Patienten, mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, von HIV/HCV-koinfizierten Patienten und von Patienten, die mit anderen Flaviviren (Dengue- und FSME-Virus) infiziert waren. Die Erprobung des Testsystems ergab, dass HCVpp zuverlässig durch die in den Serumproben enthaltenen nAk neutralisiert wurden und negative Proben verlässlich als solche erkannt wurden. Es konnte eine eindeutige Kreuzneutralisation mit anderen Genotypen beobachtet werden und eine Neutralisation durch Seren die AK gegen andere Flaviviren aufweisen ausgeschlossen werden. Obwohl die Messung von anti-HCV Antikörpern als diagnostisches Mittel in der klinischen Routinediagnostik eingesetzt wird, kann sie jedoch keine relevanten Informationen über den Krankheitsverlauf oder den möglichen Erfolg einer Therapie liefern. Ein Modellsystem zur Messung von neutralisierenden Antikörpern, wie in vorliegender Arbeit, könnten Erkenntnisse liefern, die es ermöglichen, rechtzeitig individuelle Behandlungen zu modifizieren und auf die Bedürfnisse des Patienten abzustimmen. Aus diesem Grund wurden, mit dem oben beschriebenen System, Folgeseren von chronisch HCV-infizierten Patienten untersucht, die sich einer Therapie unterzogen haben und bei denen ein unterschiedlicher Ausgang der Therapie („andauerndes Ansprechen auf die Therapie“, „Rezidiv nach initialem Ansprechen auf die Therapie“ und „kein Ansprechen auf die Therapie“) beobachtet werden konnte. Obwohl neuere Literaturquellen mit einem größeren Patientenkollektiv einen Zusammenhang zwischen der Höhe nAK und dem Verlauf einer HCV-Therapie bestätigen, konnten die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse des HCVpp-Neutralisationstests keinen Hinweis als prognostischer Marker auf einen Zusammenhang des Therapieverlaufs und der neutralisierenden Antikörperantwort geben. Jedoch konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit erzeugten HCVpp ein Surrogat-System darstellen, um in Patientenseren nAK zu messen. Ein Einsatz dieses, auf HCVpp basierenden Neutralisationstests in der klinischen Routinediagnostik wäre eine Möglichkeit, um künftig größere Patientenkollektive zu untersuchen und größere Datenmengen erheben zu können. Dadurch könnten die HCV-Therapiemöglichkeiten erheblich verbessert und individueller angepasst werden. Denkbar wäre auch der Einsatz im Blutspendewesen, um in im Screening auffällige Proben zuverlässig auf eine HCV-Infektion zu untersuchen. Außerdem ist die Möglichkeit der Anwendung dieses Neutralisationstests zu HCV Forschungszwecken eine Option, die lange Zeit nicht zur Verfügung stand und weiterhin wichtige Erkenntnisse über eine HCV-Infektion liefern kann.

Hepatitis B and C viral infections are worldwide a formidable medical problem and a threat to global health. In particular the infection with HCV is universally one of the leading causes of chronic liver diseases. The success of HCV infection therapy, which usually lasts one year with PEG IFN and the nucleoside analog Ribavirin depends on different, up until now insufficiently researched criteria (e. g. the infecting HCV-genotype). The HCV research was hindered for a long time due to the fact that it was not possible to cultivate stable HCV in sufficient amounts in cell culture. To circumvent these difficulties surrogate models -HCVpp- have recently been developed. HCVpp gives the opportunity to study the functional and infectious active form of HCV, as they mimic HCV and are infectious for certain host cells. In this research these HCVpp were used to establish a neutralization test. Defined control sera and sera from patients who had taken part in a study (because of their different outcome of therapy) have been analyzed in their ability to neutralize the HCVpp. The HCVpp used for these experiments have E1 and E2 HCV, genotype 1a, envelope glycoproteins on retroviral or lentiviral core particles and have GFP as a detection marker gene, which is easily detectable using flow cytometry technique (FACS). In this research these HCVpp, with HCV 1a envelope glycoproteins were used as the basis for the neutralization test. At first the test system had to be established and opitimised to ascertain whether HCVpp could even be used as a reliable neutralization medium. Tests with various vectors, cell culture media and PB, as transfection enhancer, were carried out. It appeared that HCVpp with lentiviral core particles as the vector, produced in high quality cell culture media yielded the best infectious particles results. Furthermore the results were improved with the addition of PB. Also the cell tropism with different B-cells and HCVpp was studied, however none of the examined cell lines were susceptible to the infection with HCVpp and could therefore not be used for the neutralization test. After the optimization of the HCVpp neutralization experiments were carried out with various patient sera. These were from non HCV infected patients, from patients with borderline results in the HCV Immunoblot, from patients infected with different HCV genotypes, from HIV/HCV coinfected patients and from patients who were infected with other Flaviviruses (Dengue- and Tick-Borne Encephalitis Virus). The trials of the HCVpp based test system had shown, that HCVpp were steadily neutralized by the neutralizing antibodies contained in the patient`s sera and that negative samples were found to be reliable. A distinct crossneutralization with other HCV genotypes was observed and a neutralization from antibodies, contained in sera infected with other Flaviviruses could be excluded. Even though the detection of anti-HCV antibodies is used as a diagnostic tool in the clinical routine investigation, it could not provide relevant information about the course of the disease or the potential success of a therapy. A system to measure neutralizing antibodies, as in this research, could lead to scientific findings, that would open new possibilities to modify individual treatments early enough and adjust to the patient`s needs. For this reason, follow up sera from chronically HCV infected patients, that underwent a therapy, with different outcome (“responder”, “non responder” and “relapse”), were examined., Although other authors in newer studies with a greater pool of patients found a correlation between the level of neutralizing antibodies and the outcome of a HCV therapy, the results of the HCVpp based neutralization test in this research could not be used as a prognostic marker and did not show any correlation between the course of the therapy and the neutralizing immune response. It could be demonstrated, that the HCVpp produced in this research represents a valuable surrogate system for the detection of neutralizing antibodies in patients sera. The application of this HCVpp based neutralization test used for clinical routine investigation of patients material, would be a possibility to study a larger pool of patients and to collect more data in the future. By this means the HCV therapy options could be significantly improved and individualized. The use of the HCVpp based neutralization test for the safe screening of blood for transfusion among blood donors or for the examination of conspicuous patients material for a HCV infection would be conceivable. To use this HCVpp based neutralization test for research is an option which was not available for a long time and which could lead furthermore to important scientific findings.