Microevolution of S. pseudintermedius isolated from one canine patient over a time span of seven years

Abstract

Staphylococcus (S.) pseudintermedius is part of the normal skin microbiota of dogs. As the most important canine coagulase-positive staphylococcal species, the opportunistic pathogen can cause a variety of different infections when the natural barrier of the host is lowered. The number of infections caused by multidrug resistant S. pseudintermedius increased in the last years – including infections with methicillinresistant S. pseudintermedius (MRSP) – limiting treatment options for veterinarians. Different screening studies investigated the frequency and genetic variation of this opportunistic pathogen obtained from colonized and infected animals, revealing a high genotypic variability. However, there is no information available on the diversity of S. pseudintermedius in single patients that are frequently affected by infections with this pathogen although recurrent infections have been described as a serious problem for single dog patients in the past. Therefore, the aims of this study were to investigate the genetic and phenotypic variability of S. pseudintermedius isolated from multiple infections of a single patient. In order to unravel the microevolution as well as the phenotypic diversity of this pathogen within one patient phenotypic and genotypic characterization was performed for methicillin-susceptible S. pseudintermedius (MSSP) and MRSP isolated from multiple wound infections of one dog between 2008 and 2014. Both, MRSP and MSSP were obtained from the patient at 18 respectively 10 time points, suggesting that the dog of interest was highly susceptible for infections caused by S. pseudintermedius. Furthermore, mixed infections with MRSP and MSSP were determined on three occasions. Worryingly, these isolates expressed the same colony morphology. This finding is of major concern for routine bacteriological diagnostic since it was shown during this work that even phenotypically similar appearing colonies can exhibit different resistance profiles. Genotypic characterization identified three distinct genotypes, whereas the two lineages ST71-MRSP and ST529-MSSP were predominant. Analysis of single nucleotide polymorphisms and the variability of mobile genetic elements showed only minor variation, revealing the isolation of very stable lineages during the investigated time period. Regarding the variability of the accessory genome content, ST71-MRSP showed the flexibility to adapt to environmental changes by the uptake of a doxycycline resistance gene encoding plasmid as well as by the loss of a phage after initial infection. The patient history revealed that the uptake of the plasmid was induced by treatment of the patient with doxycycline. Phenotypic characterization showed opposing results for ST71-MRSP and ST529-MSSP with respect to biofilm formation as well as adherence to fibrinogen. These in vitro findings lead to the assumption that MSSP and MRSP are able to use different pathways to successfully infect their hosts. No respectively minor phenotypical differences were observed for isolates sharing the same genetic background. This outcome is in accordance with the stable genomes of strains isolated over six (ST71-MRSP) respectively five years (ST529-MSSP). A reasonable explanation for the lack of variability within the identified lineages might be recurrent auto-infection, persistent infection or re- infection due to an external source.

Staphylococcus (S.) pseudintermedius ist ein Bestandteil der normalen Haut- Mikrobiota des Hundes. Als wichtigste Coagulase-positive Staphylokokken- Spezies bei Hunden kann der opportunistische Erreger eine Vielzahl unterschiedlicher Infektionskrankheiten hervorrufen wenn die natürlichen Abwehrmechanismen reduziert sind. Die Anzahl der Infektionen mit multiresistenten S. pseudintermedius (inklusive Methicillin-resistenten S. pseudintermedius (MRSP)) limitieren die Behandlungsoptionen der Tierärzte zunehmend. Verschiedene Screening-Studien haben das Vorkommen und die genetische Variabilität des opportunistischen Erregers bei kolonisierten und infizierten Tieren untersucht und dabei eine große genetische Vielfalt aufgezeigt. Allerdings gibt es bisher keine Untersuchungen zur genetischen Variabilität von S. pseudintermedius, die von multiplen Infektionen eines einizigen Patienten isoliert wurden, obwohl bekannt ist, dass rezidivierende S. pseudintermedius–Infektionen bei Patienten ein ernsthaftes Problem darstellen können. Ziel dieser Studie war es deshalb, die genetische und phänotypische Variabilität von multiplen S. pseudintermedius-Infektionen eines caninen Patienten zu untersuchen. Um die Mikro-Evolution und die phänotypische Diversität des Erregers bei einem Patienten zu untersuchen, wurden Methicillin-sensitive S. pseudintermedius (MSSP) und MRSP aus multiplen Infektionsgeschehen zwischen 2008 und 2014 von einem Patienten charakterisiert. Sowohl MRSP als auch MSSP wurden zu 18 beziehungsweise 10 Zeitpunkten nachgewiesen. Die häufige Nachweisrate lässt darauf schließen, dass der Hund sehr empfänglich gegenüber S. pseudintermedius-Infektionen ist. Zusätzlich wurden zu drei Zeitpunkten gemischte Infektionen mit MSSP und MRSP nachgewiesen. Die Isolate ließen sich nicht anhand ihrer Koloniemorphologie voneinander unterscheiden. Dieses Ergebnis ist sehr beunruhigend in Hinblick auf die phänotypische Resistenztestung von nur einer Kolonie im Rahmen der Routine-Diagnostik, da in der Studie gezeigt werden konnte dass auch Kolonien mit identischer Koloniemorphologie unterschiedliche Resistenzprofile aufweisen können. Mittels genotypischer Charakterisierung wurden drei separate Genotypen identifiziert, wobei die beiden genetische Linien ST71-MRSP und ST529-MSSP dominierten. Innerhalb dieser beiden genetischen Linien zeigten die Isolate im Vergleich nur geringe Unterschiede in Hinblick auf Punktmutationen und die Variabilität mobiler genetischer Elemente. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Isolate beider Genotypen zumindest in diesem caninen Patienten sehr erfolgreich sind. Bei ST71-MRSP waren allerdings im akzessorischen Genom Unterschiede zu erkennen. Diese Variabilität zeigt die Flexibilität von ST71-MRSP sich durch die Aufnahme eines Tetrazyklin-Resistenzgen-kodierenden Plasmids an ändernde Umweltbedingungen anzupassen. Die Aufnahme des Plasmids wurde vermutlich durch die Behandlung des Patienten mit Doxyzyklin während seiner ersten MRSPInfektion mit einem sensiblen Isolat induziert. Die phänotypische Untersuchung zeigte bei der Biofilmbildung und der Bindung zu Fibrinogen entgegengesetzte Ergebnisse für ST71-MRSP und ST529-MSSP. Diese in vitro erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSSP und MRSP einen Wirt über unterschiedliche Mechanismen erfolgreich infizieren können. Isolate mit dem gleichen genetischen Hintergrund zeigten nur geringe bzw. keine phänotypischen Unterschiede in den durchgeführten Untersuchungen. Dieses Ergebnis ist im Einklang mit den sehr stabilen Genomen von Isolaten der gleichen Linie obwohl sie über einen Zeitraum von sechs (ST71-MRSP) beziehungsweise fünf Jahren (ST529-MSSP) isoliert wurden. Wiederkehrende Autoinfektionen oder persistierende Infektionen könnten mögliche Erklärungen für die fehlende Variabilität sein.