Wirkmechanismen von Diclofenac in Zelllinien des kutanen Plattenepithelkarzinoms

Abstract

Der Apoptose-Mechanismus von Diclofenac in Non-Melanoma Skin Cancer (NMSC) ist bislang nicht geklärt. In dieser Arbeit wurden die proapoptotischen Effekte von Diclofenac, der Stellenwert von PGE2 sowie der extrinsische und intrinsische Apoptose-Signalweg in kutanen Plattenepithelkarzinom- (SCC) Zelllinien untersucht. Diclofenac induzierte in drei von vier SCC-Zelllinien Apoptose. Als wichtiges Charakteristikum von Diclofenac konnte eine Reduktion der PGE2-Spiegel unter Behandlung nachgewiesen werden. Die Supplementierung von PGE2 hob die proapoptotischen Effekte von Diclofenac im Sinne eines COX-2-abhängigen Mechanismus partiell auf. Der Todesliganden-mediierte Apoptose-Signalweg (TNF-α -, TRAIL- und CD95-Aktivierung) konnte durch Diclofenac deutlich in sensitiven SCC-Zelllinien verstärkt werden. Als entscheidende Regulation für die Sensitivierung gegenüber Todesliganden durch Diclofenac wurde die Herabregulation der cFLIP-Isoformen identifiziert. Eine Induktion oder ein Clustering von Todesrezeptoren lag unter Diclofenac- Behandlung nicht vor. Auf der Expressionsebene der Bcl-2-Proteinfamilie wies das proapoptotische Protein Bad eine Hoch- und die antiapoptotischen Bcl-2 Proteine Mcl-1 und Bcl-w eine Herabregulation auf. Die proapoptotischen Regulationen der Bcl-2-Proteine traten bezeichnenderweise nicht in der Apoptose-resistenten Zelllinie auf. Eine durch NSAIDs mediierte Regulation des antiapoptotischen Multidomäne-Proteins Bcl-w ist in dieser Arbeit erstmalig beschrieben. Die Veränderungen in der Expression der Bcl-2-Proteine resultierten in einer Translokation von Bax an die mitochondriale Membran und in einer Freisetzung von Cytochrom c als Hauptmerkmale der Aktivierung des intrinsischen (mitochondrialen) Apoptose-Signalweges. Es ließen sich verschiedene Gegenregulationen identifizieren, die als Ansatzpunkt für zukünftige Weiterentwicklungen hilfreich sein mögen: Zu den antiapoptotischen Veränderungen zählten die Herabregulation von Noxa und Puma. Weiterhin wurden eine p-ERK-Hochregulation und COX-2 Induktion identifiziert, die eine potentielle Abschwächung des Zelltodes mediieren könnten. Durch die kombinierte Behandlung von Diclofenac mit einem MEK1-/MEK2-Inhibitor wurde der antiproliferative Effekt von Diclofenac verstärkt. Die Ergebnisse zeigen erstmalig Wirkmechanismen von Diclofenac in kutanen Plattenepithelkarzinom- Zellen auf und weisen Möglichkeiten einer ‘molecular targeted‘ Therapie durch Kostimulation von Diclofenac mit ERK-Inhibitoren oder Todesliganden auf.

The mode of action of diclofenac in apoptosis regulation in Non-Melanoma Skin Cancer (NMSC) has been largely unknown. In the present work proapoptotic effects of diclofenac, the role of PGE2 as well as the extrinsic and intrinsic apoptosis pathway in squamous cell carcinoma (SCC) cell lines were analyzed. Diclofenac induced apoptosis in three of four cell lines. In the present study, we show in SCC tumor cell lines that Diclofenac treatment results in decrease of PGE2 -levels, and supplementation with synthetic PGE2 rescues cells from the proapoptotic effects of Diclofenac. Diclofenac treatment amplified death-ligand mediated apoptosis (TNF-α -, TRAIL- und CD95-transactivation). The crucial step in the synergistic effect could be found in downregulation of cFLIP. Induction or clustering of death receptors after diclofenac treatment could not be found. On the level of pro- and antiapoptotic Bcl-2 proteins, multiple changes were observed in response to Diclofenac treatment. Thus, proapoptotic Bad was upregulated and antiapoptotic Mcl-1 and Bcl-w were downregulated by Diclofenac in apoptosis sensitive cell lines. In addition to Bad and Mcl-1 regulation, in this work a completely new effect of NSAIDs at the Bcl-2 protein level, namely downregulation of Bcl-w. In contrast, these proapoptotic regulations were absent in apoptosis-resistant cell lines. Also antiapoptotic changes were observed as downregulation of proapoptotic Noxa and Puma, and these regulations were also seen in apoptosis- resistant cells. These changes resulted in translocation of Bax to the mitochondrial membrane and release of cytochrome c as hallmarks of activation of the intrinsic mitochondrial apoptosis pathway. As a further counterregulation p-ERK and COX-2 were upregulated by diclofenac. Combined treatment of SCC-cells with diclofenac and MEK1-/MEK2 inhibitor reinforced the antiproliferative effects of diclofenac. These findings illuminate the mode of action of diclofenac and may allow further adaptation and improvement of the new therapy such as shown in this work in vitro by costimulation of diclofenac with ERK-/MEK inhibitors or death ligands.