dc.contributor.author
Arbeiter, Andrea
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:21:21Z
dc.date.available
2002-10-25T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10385
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14583
dc.description
0\. Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
1.1. Abwehrmechanismen bei Pflanzen 1
1.2. Strukturmerkmale und Funktionen von Resistenzgenen 3
1.3. Isolierung von Genen 5
1.4. Arabidopsis thaliana 7
1.5. Genetik der Wirt-Pathogen-Interaktion 8
1.6. Das Krankheitsbild von Plasmodiophora brassicae 9
1.7. Die Interaktion von Plasmodiophora brassicae und Arabidopsis thaliana
10
1.8. Identifizierung und Kartierung des Resistenzgens RPB1 11
1.9. Zielsetzung der Arbeit 12
2\. Material und Methoden 14
2.1. Material 14
2.2. Methoden 20
3\. Ergebnisse 48
3.1. Identifizierung und Charakterisierung von BACs in der RPB1-Region zur
Erstellung eines BAC-Contigs 48
3.2. Molekulare Analyse in der RPB1-Region anhand veröffentlichter BAC-
Sequenzen 56
3.3. Herstellung einer Cosmidbibliothek des Arabidopsis-Ökotyps Tsu 58
3.4. Durchmusterung von Cosmidbibliotheken mit BAC-Fragmenten 59
3.5. Hochauflösende Kartierung in der RPB1-Region 63
3.6. PCR-Analysen zur Expression von Genen in der RPB1-Region 70
3.7. Untersuchungen zur genetischen Diversität zwischen den Arabidopsis-
Ökotypen 74
4\. Diskussion 79
4.1. Auswertung der Kartierungsdaten im Hinblick auf Interferenzen und
Rekombinations-cold-spots in der RPB1-Region 79
4.2. Abgleich der Daten der charakerisierten BACs mit publizierten
Ergebnissen 83
4.3. Eingrenzung des RPB1-Locus und Identifizierung entsprechender
Kandidatengene im Ökotyp Col 84
4.4. Untersuchungen zur Expression der Kandidatengene in den Ökotypen Tsu und
Cvi 86
4.5. Die RPB1-vermittelte Resistenz: Eine bekannte Abwehrreaktion, aber keine
Hinweise auf einen typischen Resistenzmechanismus 87
4.6. Bedeutung der Isolierung des RPB1-Gens für die Resistenzzüchtung 88
4.7. Ausblick auf weiterführende Arbeiten 90
5\. Zusammenfassung 93
5a. Summary 95
6\. Literaturverzeichnis 96
7\. Anhang 104
Danksagung
dc.description.abstract
Das auf Chromosom 1 von Arabidopsis thaliana lokalisierte Resistenzgen RPB1
vermittelt eine dominant vererbte Resistenz gegen den obligaten
Wurzelparasiten Plasmodiophora brassicae. Ziel der vorliegenden Arbeit war es,
die Region, in der das RPB1-Gen in vorangehenden Arbeiten lokalisiert wurde,
möglichst weit einzugrenzen, so dass ein DNA-Fragment isoliert werden kann,
welches das Resistenzgen trägt und zur Transformation anfälliger Pflanzen
eingesetzt werden kann. Hierfür war eine hochauflösende Kartierung der
RPB1-Region notwendig. Der erste Schritt im Rahmen dieser Kartierungsarbeiten
war die Erstellung eines BAC-Contigs, das den Resistenzlocus überspannt und
zur Identifizierung neuer, eng gekoppelter Marker diente. Es wurden zwei BAC-
Klone identifiziert, die den Resistenzlocus überspannen. Der Klon T12O21
grenzte den RPB1-Locus hierbei am engsten ein, und die vollständig
veröffentlichte Sequenz dieses Klons diente der weiteren molekularen Analyse
der Region. Da die BAC-Klone DNA des anfälligen Arabidopsis-Ökotyps Columbia
enthalten, wurde im Hinblick auf eine weitere Eingrenzung des RPB1-Locus eine
Cosmid-Bibliothek des resistenten Ökotyps Tsu erstellt, der auch zur
Herstellung der Kartierungspopulation verwendet wurde. Die bereits
existierende Kartierungspopulation konnte im Verlauf dieser Arbeit von 900 auf
4230 Pflanzen vergrößert werden. Zu diesem Zweck wurden zwei allelspezifische
PCR-Marker etabliert, die eine schnelle Vorselektion von Pflanzen mit
Rekombinationsereignissen nahe am Resistenzlocus ermöglichten. Insgesamt
konnten 17 neue, eng gekoppelte RFLP- und PCR-Marker in einem Bereich von ca.
200 kb um den RPB1-Locus kartiert werden. Im letzten Abschnitt der
Kartierungsarbeiten konnten einige BAC-Fragmente kartiert werden, die über
einen großen Abschnitt von ca. 29 kb alle Cosegregation mit dem RPB1-Gen
zeigten. Anhand der Kartierungsdaten erwies sich die RPB1-Region als ein
Chromosomenabschnitt mit verringerter Rekombinationshäufigkeit ("cold spot").
Der RPB1-Locus wurde gemäß der Sequenz des Ökotyps Columbia auf einen Bereich
von ca. 71 kb eingegrenzt. In diesem Abschnitt liegen drei Pseudogene und 13
codierende Sequenzen, von denen sechs in einem Abschnitt liegen, der absolute
Kopplung mit dem Resistenzlocus zeigt. Die anderen sieben Gene liegen in den
Abschnitten rechts und links von der cosegregierenden Region und müssen
ebenfalls als Kandidatengene eingestuft werden. Aus der Tsu-Cosmidbibliothek
wurde ein Cosmidklon isoliert, der drei dieser Kandidatengene enthält. Bei
zwei der sechs Gene im cosegregierenden Abschnitt handelt es sich mit großer
Wahrscheinlichkeit um Col-spezifische Gene, zwei andere Gene sind in
duplizierter Form auf Chromosom 5 vorhanden. Keines der 13 Gene konnte einem
bekannten Gen bzw. Protein zugeordnet werden oder zeigte Ähnlichkeiten zu
bereits identifizierten Resistenzgenen, weshalb sie in den Datenbanken als
hypothetische bzw. unbekannte Gene eingestuft wurden. In cDNA-Analysen wurde
für 10 der 13 codierenden Sequenzen eine Expression in mindestens einem der
beiden Ökotypen Tsu (resistent) und Cvi (anfällig) nachgewiesen. Ein Gen
(CDS9) wurde sowohl bei infizierten als auch bei nicht infizierten Pflanzen
nur im resistenten Ökotyp Tsu exprimiert. In Sequenzvergleichen der beiden
Ökotypen Col und Tsu und in PCR-Analysen der vier Ökotypen Tsu, Cvi, RLD und
Col konnte ein hoher Polymorphiegrad mit einer großen Anzahl an
Einzelnukleotidpolymorhismen zwischen den einzelnen Arabidopsis-Ökotypen
festgestellt werden. Mit den durchgeführten Kartierungsarbeiten und der
molekularen Analyse der RPB1-Region wurde die Basis für nachfolgende
Komplementationsversuche geschaffen, die zur Isolierung des RPB1-Gens
notwendig sind.
de
dc.description.abstract
The resistance gene RPB1 is located on chromosome 1 of Arabidopsis thaliana
and confers a dominantly inherited resistance to the obligate biotrophic
pathogen Plasmodiophora brassicae. The objective of this work was to narrow
down the region where the RPB1 gene had been mapped in preceding studies as
far as possible, in order to isolate a DNA fragment carrying the resistance
gene, which could then be used for the transformation of susceptible plants.
To achieve this, high resolution mapping studies had to be done in the
RPB1-region. The first step was the construction of a BAC contig that spans
the resistance locus and was used to identify new, closely linked markers. Two
BAC clones which span the RPB1 locus were identified. The published DNA
sequence of the smaller one of these two clones, BAC T12O21, was used for
further molecular analysis of this region. Since the BAC clones carry DNA of
the susceptible Arabidopsis ecotype Columbia, a cosmid library of the
resistant ecotype Tsu-0 (the ecotype used for building up the mapping
population) was created. The existing mapping population was expanded from 900
to 4230 plants. Two allelspecific PCR markers were established that permitted
a quick preselection of plants with recombination events near the RPB1 locus.
Altogether 17 new closely linked RFLP and PCR markers were mapped in a section
of 200 kb around the resistance locus. In the last part of the mapping studies
some BAC fragments showing cosegregation with the resistance locus in a large
section of approximately 29 kb could be mapped. According to these mapping
data the RPB1-region is a section on chromosome 1 with a reduced number of
recombination events (cold spot). The RPB1 locus was narrowed down to a region
of approximately 71 kb according to the Col sequence. In this section three
pseudogenes and 13 coding sequences were located. Six of these 13 candidate
genes were placed in the region that showed cosegregation with RPB1. The other
seven genes were placed in the regions to the left and to the right of this
cosegregating region and have to be classified as candidate genes too. One
cosmid clone was isolated from the Tsu library that carries three of these
candidate genes. Two of the six genes in the cosegregating section are very
probably Col specific, two other genes are duplicated on chromosome 5. None of
the 13 coding sequences match known genes or proteins or have similarities to
previously identified resistance genes. Therefore these genes were classified
as hypothetical or unknown genes in the databases. In cDNA analyses 10 of
these 13 coding sequences were confirmed to be expressed in at least one of
the two ecotypes Tsu (resistant) and Cvi (susceptible). One gene (CDS9) was
exclusively expressed in the resistant ecotype Tsu in both infected and non-
infected plants. A high rate of polymorphism with a large number of single-
nucleotide-polymorhisms between the individual ecotypes could be detected by
sequence comparison of the two ecotypes Tsu and Col or PCR analyses of the
four ecotypes Tsu, Cvi, RLD and Col. The high resolution mapping and the
molecular analysis of the RPB1-region can now serve as the basis for
subsequent complementation studies that will be necessary for isolating the
RPB1 gene.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Arabidopsis thaliana
dc.subject
Plasmodiophora brassicae
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Hochauflösende Kartierung und molekulare Analyse der Region um den
Resistenzlocus RPB1 auf Chromosom 1 von Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Maria Dolores Sacristán
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Thomas Schmülling
dc.date.accepted
2002-04-12
dc.date.embargoEnd
2002-11-01
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002179
dc.title.translated
High-resolution mapping and molecular analysis of the region around the
resistance locus RPB1 on chromosome 1 of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000577
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/217/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000577
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dcterms.accessRights.openaire
open access