Optimierung der T-Zell-Beladung mit magnetischen Nanopartikeln zur ZNS- Bildgebung mittels MRT in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose

Abstract

Die MS ist eine Erkrankung, die zu einer frühen Invalidität der Patienten führen kann und daher gravierende Konsequenzen für Patienten und ihre Angehörigen birgt. Die therapeutischen Möglichkeiten sind bislang sehr limitiert. Dies liegt nicht zuletzt am mangelnden Verständnis der Pathogenese. Bei der MS handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, die vermutlich durch autoreaktive T-Zellen initiiert wird. Die Rolle von T-Zellen in der Erkrankungsentwicklung ist bisher nicht hinreichend geklärt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine neue Methode zu etablieren, die die nicht-invasive Verfolgung von T-Zellen in vivo ermöglicht. Sie soll eingesetzt werden, um einen Beitrag zur Aufklärung pathogenetischer Mechanismen der Neuroinflammation und Neurodegeneration zunächst im Rahmen der EAE, letztendlich aber auch für andere Krankheitsmodelle, zu liefern. Obwohl die Markierung und das in vivo Zelltracking von Makrophagen und Stammzellen schon weitestgehend optimiert sind, stellen T-Zellen auf Grund der fehlenden phagozytotischen Kapazität weiterhin eine große Herausforderung dar. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit eine neuartige Gruppe von Partikeln eingesetzt, die eine sehr viel effizientere Aufnahme in die Zellen ermöglichen soll. Repräsentant dieser von Zitrat umhüllten Partikel ist das sogenannte VSOP (very small iron oxide particle). Gekoppelt an Protaminsulfat, einem vielfach bewährten Transfektionsagens, soll sich die Transfektionskapazität der VSOP-Partikel potenzieren und dadurch auch die Beladung von Zellen ermöglichen, die kaum phagozytotische Kapazitäten besitzen. Das aus der Konjugation von VSOP und Protaminsulfat hervorgehende VProt wurde hinsichtlich seiner Beladungsfähigkeit, sowie dem potentiellen Einfluss auf Vitalität und Funktion der beladenen Zellen eingehend untersucht und mit nativen VSOP verglichen. Im in vitro System wurde zunächst ein effizientes Beladungsprotokoll mit VProt für die humanen HeLa-Zellen erstellt, um vorab eine Einschätzung von Beladungszeiten und -konzentrationen zu ermöglichen, die bei effektiver Partikelaufnahme eine möglichst geringe Toxizität gewährleisten. Im Anschluss wurden die gewonnen Erkenntnisse auf frische enzephalitogene T-Zellen von SJL/J-Mäusen übertragen, um ein Methodenprotokoll für die effiziente Beladung von T-Zellen mit VProt zu etablieren. Daraufhin wurden die beladenen T-Zellen in vivo in einem Mausmodell der MS, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), auf den Erhalt ihres enzephalitogenen Potenzials untersucht. Die Applikation von Gadolinium-DTPA diente dazu, in der MRT Permeabilitätsstörungen der Blut-Hirn-Schranke in T1-gewichteten Sequenzen sichtbar zu machen. Darüberhinaus wurde die intrathekale Injektion VProt enthaltender T-Zellen angewendet, um schließlich die Fähigkeit dieser T-Zellen zur Signalgebung im MRT zu ermitteln. Die Transition dieser Methode von „Bench to Bedside“ in den humanen Organismus soll zu einem späteren Zeitpunkt die Übertragbarkeit auf die MS, sowie ein weites Spektrum weiterer Pathologien ermöglichen. Durch das auf diesem Wege erlangte bessere Verständnis der Pathogenese können gezielt therapeutische Möglichkeiten ausgelotet und durch Verkürzung des Zeitraums bis zur Diagnosestellung zukünftig auch ein früheres therapeutisches Eingreifen erreicht werden.

We present a novel highly efficient protocol to magnetically label T cells applying electrostatically stabilized very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOP) in combination with protamine, that we developed in preparation of future magnetic resonance imaging (MRI) in vivo studies on cell migration, e.g. in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of multiple sclerosis. Encephalitogenic T cells an HeLa cells were co- incubated with VSOP, or with protamine-complexed VSOP (VProt), respectively, at different conditions, optimizing concentrations and incubation times. Labelling efficacy was determined by atomic absorption spectrometry as well as histologically and by relaxometry, and evaluated on a 7 Tesla MR system. Furthermore, we investigated effects on t cell functionality by observing gadolinium leakage in pEAE mice after transfer of VProt labeled T cells. Results: T cell co-incubation with VSOP resulted in an efficient cellular iron uptake. T2 times of labeled cells dropped significantly, resulting in prominent hypointensity on T2*-weighted scans. Optimal labelling efficacy was achieved by VProt. Conclusions: VProt yields a highly efficient T cell labelling, adapted for applications in future in vivo trials.