Identification and characterisation of new genes associated to multiminicore disease

Abstract

Congenital myopathies are rare genetic disorders characterized by neonatal hypotonia, delayed motor development and muscle weakness, associated with characteristic histological changes in the structure of muscle fibres visible on the patients’ muscle biopsies. Our laboratory is particularly interested in the study of core myopathies, which are emerging as the most prevalent form of congenital myopathy, and especially of multi-minicore disease (MmD), which is characterised by multiple focal short areas of mitochondria depletion and sarcomere disorganisation (cores) within muscle fibers. Our group identified most of the genes associated to this genetically and phenotypically heterogeneous condition. However, at least 30% of multiminicore disease cases are not associated with the known genes and remain genetically uncharacterized. During my PhD, my objective was to identify and characterize new genes responsible for this condition. The study of a large consanguineous family by homozygosity mapping allowed the identification of a homozygous nonsense mutation in the coding sequence of a transcriptional coactivator (named thereafter TCA), which had never been associated with a muscle condition. The 3 affected patients presented with a novel, very severe form of congenital myopathy with an unreported histological pattern associating minicores, nuclear internalization and cap lesions. qPCR and western blotting showed absence of messenger and protein on patient samples, suggesting NMD (nonsense mediated decay). The increased TCA expression profile in murine axial skeletal muscles is consistent with the clinical presentation. Also, I found increased protein expression during in vitro C2C12 myoblastic cell line differentiation, which is compatible with a contribution to myogenesis. Subsequently, I performed microarray analysis on a transient TCA silencing model, which disclosed a tendency to downregulation of muscle and contractile proteins (in differentiation conditions), and an upregulation of cell cycle proteins (in proliferative conditions), suggesting a role of TCA in regulating the proliferation/differentiation balance in muscle. Consistently, Dual Reporter Luciferase assays performed on proliferative C2C12 identified p21 as an activated target of TCA suggesting a role of the protein in the cell cycle exit regulation more specifically. Thus, we report a novel congenital muscle condition with a unique histological pattern, stressing the histological overlap of different forms of congenital myopathies and muscular dystrophies. We characterize a new gene in human genetic conditions and a novel regulator of the proliferation/differentiation balance in muscle. In parallel, to identify other genes associated with MmD, I investigated four highly informative and consanguineous families with MmD non-associated with the known genes. By crossing homozygosity mapping data and massive parallel sequencing, I identified a candidate gene, which encodes a protein potentially implicated in cell stemness and linked to p53 activity. Confirmation of the pathogeneicity of this change and gene are in progress in our laboratory. A novel transcriptional coactivator is pivotal in regulating the balance between proliferation and differentiation of myogenic progenitors and is mutated in a novel form of congenital myopathy. Davignon et al. – in preparation

Identifikation und Charakterisierung eines neuen Genes das mit einem unbeschriebenen Phänotyp der Kongenitalen Myopathie korreliert. Kongenitale Myopathien sind seltene genetische Erkrankungen zu deren Symptomen neonatale Hypotonie, eine verspätete motorische Entwicklung und Muskelschwäche gehören. Sie sind mit charakteristischen histologischen Veränderungen in der Muskelfaserstruktur assoziiert. Unser Labor beschäftigt sich mit der Erforschung der Kongenitalen Myopathien – insbesondere der Multiminicore Krankheit (MmD), die durch multiple fokale kurze Areale mit mitrochondrialem Abbau die zur Auflösung des Sarkomers führen charakterisiert ist. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte die meisten der mit dieser Krankheit assoziierte Gene. Dennoch sind 30% der Multiminicore Erkrankungen sind nicht mit diesen Genen assoziiert und noch nicht genetisch charakterisiert. Das Ziel meiner Promotionsarbeit war die Identifikation und Charakterisierung neuer MmD Gene. Als Vorarbeiten hatte unser Labor eine Großfamilie mit drei Patienten untersucht, die ungewöhnliche Minicores mit Kerninternalisierungen und Cap- Läsionen aufwiesen, als Zeichen einer bisher unbekannten, schweren Form der Kongenitalen Myopathie. Die zugrundeliegende homozygote Nonsens-Mutation des Transkriptionscoaktivators (TCA) wurde zuvor nicht mit der Kongenitalen Myopathie in Verbindung gebracht. Der Verlust von TCA mRNA und Protein wurde in Realtime PCR und Western Blot dokumentiert und impliziert nonsense mediated decay (NMD) als moleklulare Grundlage der Erkrankung. Das Expressionsprofil von TCA im Skeletmuskel in vivo als auch in vitro (C2C12). Letztere wiesen eine erhöhte Expression von TCA während der Differzierung auf. Dies unterstützt die Hypothese der Beteiligung von TCA an der Myogenese. Nachfolgend untersuchte ich TCA defiziente C2C12 Zelllinien mit Hilfe einer Microarray Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine Runterregulierung von kontraktilen Muskelproteinen und gleichzeitig die Hochregulierung von Zell- Zyklus-Proteinen. Dies suggeriert die Beteiligung von TCA an der Regulierung der Proliferation und der Differenzierung im Skelettmuskel. Zudem zeigten Reporter- Luciferase-Assays in proliferierenden, TCA überexpremierenden C2C12 Zellen eine direkte und aktivierende Interaktion zu p21, was die Rolle von TCA auf das Ende des Zell-Zyklus spezifiziert. Wir beschreiben somit eine neue kongenitale Muskelkondition mit einem einzigartigen histologischen Muster, die eine histologische Überlappung zwischen verschiedenen Kongenitalen Myopathien und Muskeldystrophien aufzeigt. Zudem charakterisierten wir unter humanen genetischen Bedingungen ein neues Gen, welches die Proliferation und Differenzierung des Muskels reguliert. Weitergehende Untersuchungen des Gens werden in unserem Labor bereits durchgeführt. Parallel untersuchte ich fünf weitere Familien mit MmD. Dabei identifizierte ich ein weiteres Gen dessen Protein potentiellen Einfluss auf den Differenzierungsmechanismus hat und mit der Aktivität von p53 verknüpft zu sein scheint. Die Pathogenität der Veränderung und das Gen werden in unserem Labor weiter untersucht. Eine Veröffentlichung mit dem Titel „A novel transcriptional coactivator is pivotal in regulating the balance between proliferation and differentiation of myogenic progenitors and is mutated in a novel form of congenital myopathy.” ist in Bearbeitung. Davignon et al