Nachweis von toxikologisch relevanten Wirkstoffen in Nägeln und Haaren mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Kopplung (LC-MS/MS)

Abstract

Der Genuss von illegalen Rauschmitteln in unserer Gesellschaft ist weit verbreitet. Der Konsum von Rauschmitteln kann nicht nur Auswirkungen auf die Konsumenten selbst haben, sondern er kann auch eine Gefährdung von anderen Personen darstellen. Gefährdet sind zum Beispiel andere Verkehrsteilnehmer oder die eigenen Kinder. Weiterhin ist der Einsatz von Schmerzmitteln, vor allem als frei verkäufliche Arzneimittel, weit verbreitet und birgt aufgrund von auftretenden Nebenwirkungen etliche Gefahren. Mit Hilfe der Haaranalyse können Abstinenzbelegungen im Rahmen der Fahreignungsbegutachtung oder bei Sorgerechtsstreitigkeiten rückwirkend belegt werden. Ein retrospektiver Nachweis über die regelmäßige Aufnahme von Arzneimitteln, wie zum Beispiel im Rahmen des Drug Monitoring ist ebenfalls mit Hilfe der Haaranalyse möglich. Im Rahmen einer forensisch toxikologischen Untersuchung kann mit der Analyse der Haare die Gewöhnung an toxikologisch relevante Substanzen abgeschätzt werden. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe der Haaranalyse mehre Fragestellungen zu bearbeiten. Dabei sollte eine Langzeiteinnahme von nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) nachgewiesen und anhand von Todesfällen untersucht werden, ob die Langzeiteinnahme von NSAR mit dem Auftreten von gastrointestinalen Läsionen korreliert. Eine weitere Aufgabe war, ob mit der Haaranalyse auf illegale Rauschmittel die Abschätzung einer Kindeswohlgefährdung getroffen werden kann. Weiterhin sollte überprüft werden, ob die Konsummarker Cuscohygrin und Hygrin für die Unterscheidung von Cocakauen und illegalem Cocainkonsum geeignet sind. Die Untersuchung, ob Nägel als alternative Matrix zu Haaren war die letzte Fragestellung für den Fall, dass für einige Untersuchungen keine Haare für einen retrospektiven Nachweis einer Substanzaufnahme zur Verfügung stehen. Für den Nachweis von NSAR wurde eine Nachweismethode nach den Richtlinien der Gesellschaft für Forensische und Toxikologische Chemie (GTFCh) mittels LC-Time of Flight-MS (LC-QTOF-MS) erfolgreich validiert. Der Fallgruppe (n = 132) wurden Todesfälle zugeordnet, die gastrointestinale Läsionen aufwiesen und der Kontrollgruppe (n = 136) Todesfälle, bei denen keine gastrointestinalen Läsionen während der Obduktion festgestellt werden konnten. Weiterhin wurden die zugehörigen Blutproben mittels HPLC-DAD auf NSAR untersucht. Die Ergebnisse der Blutanalyse konnten keinen signifikanten Unterschied zwischen der Fall- und Kontrollgruppe zeigen. Mit Hilfe der Haaranalyse konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der Fall- und Kontrollgruppe mit dem Nachweis von NSAR gezeigt werden. In der Fallgruppe wurden 67% der Haarproben positiv auf mindestens ein NSAR getestet und im Gegensatz dazu, wurden in der Kontrollgruppe nur 38% der Haarproben positiv auf mindestens ein NSAR getestet. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bei tödlichen gastrointestinalen Blutungen der Analyt Ibuprofen mit 62% am häufigsten nachgewiesen werden konnte. Protonenpumpenhemmer konnten nur in 3 Haarproben nachgewiesen werden, wobei in 19% der Blutproben mindestens ein Protonenpumpenhemmer nachgewiesen werden konnte. Hier dient als Erklärungsansatz, dass offenbar die Protonenpumpenhemmer schlecht in das Haar eingelagert werden [77]. Anhand des Studienkollektives konnte gezeigt werden, dass eine signifikante Korrelation zwischen der Langzeiteinnahme von NSAR und dem Auftreten von gastrointestinalen Läsionen besteht. Die natürlichen Cocaalkaloide Cuscohygrin und Hygrin kommen in den Blättern der Cocapflanze vor, sind jedoch nicht in illegalen Cocainzubereitungen nachweisbar. Aus diesem Grund eignen sich die beiden Pryrrolidin-Alkaloide als Konsummarker, um zwischen dem traditionellen und legalen Kauen der Cocablätter in Südamerika und den Cocainkonsumenten zu unterscheiden. In der Arbeit wurden die Blätter der Cocapflanze und verschiedene Zwischenprodukte bei der Herstellung der Cocapaste auf Cocaalkaloide mit Hilfe einer basisvalidierten Methode untersucht. Es sollte die Frage geklärt werden, bei welchen Herstellungsschritten die Cocaalkaloide Cuscohygrin und Hygrin verloren gehen und sich die Konzentrationen der anderen Cocaalkaloide wie Cocain, Cinnamoylcocain, Tropacocain und Methylecgonin erhöhen. Da Cuscohygrin und Hygrin nur in einem sehr geringen Maße mittels Kerosin aus den Cocablättern extrahiert werden und ebenfalls nicht unter sauren Bedingungen ausfallen, sind die beiden Alkaloide vielversprechende Marker für die Unterscheidung zwischen dem legalen Cocakauen in Südamerika und dem illegalen Cocainkonsum. Zwischen 2011 und 2014 wurden insgesamt 388 Haarproben von Kindern und 594 Haarproben von Eltern und verantwortlichen Bezugspersonen gesammelt. Die Haarproben wurden auf die gängigen Betäubungsmittel wie Cocain, Methadon, Opiate, Amphetamine, Ecstasywirkstoffe, Cannabinoide sowie Benzodiazepine mittels LC- MS/MS und GC-MS untersucht. Wenn Haarproben der Erwachsenen positiv auf die oben genannten Betäubungsmittel getestet wurden, dann fand ebenfalls eine Haaranalyse der Kinder statt. Haaranalysen in verschiedenen zeitlichen Abständen (meist nach 6 und 12 Monaten) sollte zeigen, ob die Erwachsenen den Konsum von Rauschmitteln einstellen und die Kinder keinen Umgang mehr mit illegalen Rauschmitteln haben. Es konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass in den Kinderhaaren ein gleiches Analytenmuster wie bei den im gleichen Haushalt lebenden Erwachsenen nachgewiesen werden konnten. In den Kinderhaarproben (n = 296) aus den Jahren 2011-2014 konnten verschiedene illegale Betäubungsmittel wie u.a. Methadon, Heroinmetabolite, Cocain und THC nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden in 80 Kinderhaarproben keine illegalen Betäubungsmittel nachgewiesen. Anhand der Studie konnte gezeigt werden, dass Kinderhaare eine empfindliche Methode für den Nachweis eines Betäubungsmittelumganges ist. Dieser Aspekt kann bei der Einschätzung einer Kindeswohlgefährdung eine wichtige Rolle spielen. Für den retrospektiven Nachweis einer zurückliegenden Substanzaufnahme, sollte eine potentielle alternative Matrix zu Haaren gefunden werden. Es wurden 70 Haar- und Nagelproben von Todesfällen mittels ungerichteter Suchanalyse untersucht. Die Messungen wurden mittels LC-QTOF-MS durchgeführt. Für den quantitativen Nachweis von 76 toxikologisch relevanten Substanzen in Nägeln und Haaren wurden zwei empfindliche und schnelle Methoden nach den Richtlinien der GTFCh mittels LC-QQQ-MS validiert. Die Proben wurden mittels einer Kugelmühle gemahlen und für 2 x 18 Stunden extrahiert. Für die beiden Studien wurden Fälle ausgewählt, in deren Vorgeschichte ein Drogenmissbrauch, eine Polymedikation oder eine psychische Vorerkrankung mit entsprechender Medikation ermittelt werden konnte. Insgesamt wurden 89 unterschiedliche toxikologisch relevante Substanzen mittels LC-QTOF-MS nachgewiesen. Häufig wurden die Analyte Metoprolol, Paracetamol und Metoclopramid in den Haar- und Nagelproben nachgewiesen. In der zweiten Studie wurden Haar- und Nagelproben von 7 Todesfällen untersucht und die Analytkonzentrationen bestimmt. In 5 Fällen konnten die Nägel und Haarproben segmentiert werden und in 2 Fällen konnten nur Nagelclippings für die Untersuchung herangezogen werden. Anhand der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die ermittelten Analytkonzentrationen in den Haar- und Nagelproben nicht miteinander vergleichbar sind. Daraufhin wurden Konzentrationsverhältnisse von Substanzen und ihren Metaboliten bestimmt. Ähnliche Konzentrationsverhältnisse zwischen Haaren und Nägeln wurden für MDA/MDMA, EDDP/Methadon und Bisnortilidin/Nortilidin ermittelt. Anhand von gleichen Konzentrationsverhältnissen kann eine ähnliche Substanzeinlagerung in Haaren und Nägeln vermutet werden. Durch das Mahlen der Proben während der Probenvorbereitung, konnte ein Analytverlust anhand eines Falles gezeigt werden. In diesem Fall wurden die Haare wie in der Routine auch üblich nur in kleine Stückchen geschnitten (ca. 1-2 mm groß) bzw. im Rahmen der Studie gemahlen. Besonders bei dem primären Heroinmetaboliten 6-Monoacetylmorphin (6-MAM) konnte ein deutlicher Konzentrationsverlust durch das Mahlen der Haarprobe gezeigt werden. Eine alternative Probenaufarbeitung für die Matrix Nagel sollte somit Teil zukünftiger Forschungsarbeiten sein. Im Rahmen der beiden Studien konnte sowohl gezeigt werden, dass Nägel als potenzielle alternative Matrix zu Haaren in Frage kommen und die qualitativen Ergebnisse der beiden Matrices sehr gut vergleichbar sind. Weiterhin zeigte sich anhand von Realfällen, dass sich für einige Substanzen und deren Metabolite ähnliche Konzentrationsverhältnisse nachweisen ließen, die ein Hinweis für eine ähnliche Einlagerung in die beiden Matrices sein können. Haupteinlagerungswege in den Nagel scheinen während der Bildung des Nagels in der germinalen Matrix, über den Schweiß und aufgrund externer Kontamination zu sein. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Haaranalytik für verschiedene Fragestellungen erfolgreich eingesetzt werden kann. Ein retrospektiver Nachweis einer Substanzaufnahme konnte ebenfalls für Fuß- und Fingernägel gezeigt werden und Nägel können auf der Grundlage der Ergebnisse als alternative Matrix genutzt werden, wenn keine Haare für eine Analyse zur Verfügung stehen.

According to the present Drug Report of Germany, it is apparent, that the addiction to illicit drugs and pharmaceuticals is a major problem in western society. Drug abuse was not only result in consequences for the person themselves; there could also be other people affected. Their own children or traffic participants are at risk of drug users. Furthermore, pain killers that are commonly used and easily available over the counter add to an increased risk of side effects. Hair analysis has become a routine technique for the retrospective detection of contact to illicit drugs in driving ability examination or for example in the context of a custody case. Hair analysis has been proven to be particularly suitable for these tasks due to the long time window of drug detection for up to 6 month. The detection of prior drug intake could also be helpful for therapeutic drug monitoring. Hair samples are often analyzed as part of a postmortem investigation, as their analysis could reveal further information to blood analysis about potential drug addiction. The aim of this research project was to use hair analysis in different fields of application. The first study investigated the correlation between chronic use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and gastrointestinal lesions by analyzing blood and hair samples from postmortem cases. In addition, hair analysis was used for the retrospective detection of illicit drugs in hair samples from parents/caregivers and children. Furthermore, markers of coca chewing are desired for the discrimination between chewing of coca leaves and abuse of cocaine. The two natural coca alkaloids hygrine and cuscohygrine were tested and it could be shown, that they might be suitable markers for this task. By analyzing material of different steps of cocaine production, it was investigated in which steps the two alkaloids are separated from cocaine. A further research project was done to verify the usefulness of nails as an alternative technique to hair analysis. This alternative technique may be used for toxicological investigations in cases where no hair is available. Method validation was performed according to the guidelines of the German Society of Toxicological and Forensic Chemistry (GTFCh) for the detection of NSAID by the use of LC-quadrupole time of flight-MS (LC-QTOF-MS). Corpses with gastrointestinal lesions were selected for the case group (n = 132) and those without any lesions were placed into the control group (n = 136). Blood samples from all cases were analyzed by HPLC-DAD. No significant discrimination between case and control group could be achieved by the blood analysis. In contrast, the hair analysis showed a significant difference between the case and the control group. Out of the case group 76% were tested positive for one or more NSAIDs while only 38% of the hair samples from the control group included one or more NSAIDs. Results from blood analysis indicated that most of the deceased with gastrointestinal lesions, which were discovered by autopsy, did not consume NSAIDs near to the time of death. In contrast, hair analysis showed the influence of long-term use of NSAIDs on gastrointestinal lesions in hair samples from postmortem cases. Proton pump inhibitors were rarely detected in hair samples. Rare incorporation into hair may be the reason for this. For the discrimination between traditional chewing of coca leaves and illegal cocaine use two potential markers were established. The aim of this study was to clarify in which steps of the illegal cocaine production hygrine and cuscohygrine are lost. Analyses of the coca leaves, different extraction steps and cocapaste were done by LC-triple quadrupole-MS (LC-QQQ-MS). It could be shown, that hygrine and cuscohygrine are lost in the first steps of the illegal cocaine production due to poor extraction with kerosene. In addition to this, the concentration changes of cocaine, cinnamolycocaine, tropacocaine and ecgonine methylester were also estimated by analyzing the different extraction steps of the cocaine production. Based on these results, hygrine and cuscohygrine fulfill the conditions as markers for coca chewing. Between 2011 and 2014 hair samples from parents/caregivers and children were collected for the detection of the use or ambulatory with illicit drugs. In summary, 388 hair samples from children and 594 hair samples from parents/caregivers were analyzed by GC-MS and LC-MS/MS. Hair samples from children were only tested in case of positive hair samples from the parents/caregivers. The hair samples were for cocaine, methadone, opiates, amphetamines, ecstasy, cannabinoids and benzodiazepines. Cannabinoids were analyzed by GC-MS and all the other drugs by LC-MS/MS. To clarify the cooperation from the parents/caregivers, a follow-up hair tests were done after 6 or 12 month. This study could estimate, that the hair samples of the children often showed a similar or the same drug profile as their parents. Hair analysis of children is a sensitive indicator of the handling of drugs in their environment and to estimate the best interests of the child. Between 2011-2014 hair samples from children (n = 296) were tested positive for different illicit drugs, e.g. methadone, heroin, cocaine and delta-9-tetrahydrocannabinol (THC). The hair testing of the children revealed no drugs in 80 hair samples. Finally, hair analysis was proven to be a very efficient working instrument for the estimation of the best interests of the child. The usefulness of nails as an alternative technique to hair was tested in two further projects. In the first study, 70 hair and nail samples from postmortem cases were analyzed by LC-QTOF-MS. In the second study hair and nail segments from corpses were analyzed by LC-QQQ-MS after method validation according to the GTFCh guidelines. The extraction of hair and nail samples was done for 2 x 18 hours. Deceased with a promising case history, e.g. known drug addiction were selected for this work. The samples were measured in auto MS/MS mode for the qualitative screening by LC-QTOF-MS after the extraction steps. In summary, 89 substances were detected by the general unknown screening. Most frequently detected substances were metoprolol, acetaminophen and metoclopramide in hair and nail samples in the first study. In the second study, nail and hair samples from 7 corpses were segmented and the concentration of drugs were determined by LC-QQQ-MS. Based on the results of this work, concentrations of drugs are not comparable in hair and nail segments. Due to this, concentration ratios of selected analytes and their metabolites were calculated. Similar concentration ratios for MDA/MDMA, EDDP/methadone and bisnortilidine/nortilidine were estimated. Similar concentration ratios may indicate equal incorporation ways into hair and nail matrix. By milling hair and nail samples, concentration loss could be explained. In addition, analyte losses could be observed due to sample preparation. Routinely, hair samples are only cut into small pieces before extraction. Case 5 showed increased concentration of 6-MAM in milled hair sample in contrast to the hair sample, which further research is needed concerning nail sample preparation. Nail analysis was confirmed as a useful retrospective technique for the detection of previous drug intake. The analyses of nail and hair samples showed strong correlation to the case history and the drug incorporation in hair and nail samples seem to be comparable. The qualitative results from the general unknown screening showed only slight differences between hair and nail analysis. Based on the findings from the second study, main mechanisms of drug incorporation into nails may be via blood during the formation of the nail plate by the germinal matrix, via sweat and by external contamination. In conclusion, the results of this research work could show the usefulness of hair analysis for different fields of application. Furthermore, nails could be proven to incorporate substances similar to hair and therefore be used as an alternative technique in the retrospective detection of drug intake in cases where no hair is available.