The culture and differentiation of human pluripotent cells into brown and white adipocytes

Abstract

Human pluripotent stem cells have the potential to make substantial contributions to developmental biology and revolutionize medical research. However, their utility thus far has been limited by a variety of basic technical challenges. The existing standard culture methodology is laborious, inefficient, and inconsistent. Additionally, many applications are hindered by a dearth of suitable differentiation methods, rendering many important cell types inaccessible. For instance, the field of adipocyte biology, central in the fight against the emerging obesity epidemic, lacks an efficient and robust protocol to generate brown and white adipocytes. This thesis consists of two parts, the first of which concerns the development of an enhanced hPSC culture platform. Here, it is demonstrated that the newly developed enhanced culture platform permits the efficient and robust culture of hPSCs. The platform was able to address, and improve upon, key limitations of the most commonly used standard culture platform. The growth and maintenance of hPSCs is thereby significantly improved and genetic manipulation substantially facilitated. The second part of this thesis focuses upon the development of differentiation techniques deriving brown and white adipocytes from hPSCs. Herein, we have developed a strategy to induce the ectopic expression of lineage specific transcription factors, thereby guiding the differentiation into these respective cell types. Based on molecular and morphological markers, we conclude that the transient overexpression of PPARG2 can differentiate hPSC- derived MPCs robustly and efficiently into mature white adipocytes. The functional capabilities of the resulting cells were evaluated, and revealed abilities to perform lipolysis and de-novo fatty acid synthesis, internalize glucose in response to insulin, and release adipokines upon appropriate stimulation. Based upon their functional repertoire, we conclude that we have successfully established an in vitro hPSC-based system to generate mature white adipocytes. Furthermore, these results indicate that hPSC-derived white adipocytes are suitable to model human disorders, such as obesity, lipodystrophy, or diabetes mellitus type 2. Recently, the discovery of brown adipose tissue in adult humans, a tissue known to be highly metabolically active in rodents, has sparked extensive interest in investigating its potential manipulation and use as an anti-obesity tool. However, very little is known about the tissue in humans and no in-vitro cell model exist. In an effort aimed at establishing such a model, we screened the transcription factors PPARG2, CEBPB and PRDM16 for their potential to induce brown adipocyte fate from hPSCs. Based on morphological and molecular characterization, we were able to identify the transcription factor combinations PPARG2/CEBPB and PPARG2/CEBPB/PRDM16 as potential candidates. We confirmed a brown adipocyte identity through extensive characterization of the molecular and functional properties of the cells and directly comparing them to programmed white adipocytes. Importantly, these cells feature an increased oxygen consumption and extracellular acidification rate, as well as greater cellular glucose uptake when compared to white adipocytes, all strong indicators associated with a substantially increased metabolic rate. Lastly, we reintroduced the hPSC-derived cells into immunodeficient mice to access their ability to generate adipose tissue in-vivo. After 6 weeks the transplanted white and brown adipocytes had formed fat pads which resembled the associated primary tissue in morphological and molecular characteristics. Human brown adipocytes take up large quantities of glucose when stimulated. In fact, this characteristic enabled the first identification of brown adipose tissue in adults by measuring radioactively labeled glucose via PET-CT. Utilizing a similar approach, we were able to demonstrate that hPSC-derived programmed brown adipocytes have the capability to act as a glucose sink in-vivo. While newly transplanted human brown adipocytes were soon enriched in radioactively labeled glucose, the control white adipocyte transplants refrain from accumulating significant amounts. Obesity is on the verge of becoming a world- wide epidemic with deleterious consequences for the living standard, health, and longevity of a large part of the population. Currently, only few interventions are known to mitigate the most severe health consequences, let alone induce long-term weight reduction in patients. The findings presented in this thesis make important contributions in the ongoing search for remedies to these problems. The introduction of a highly efficient system to differentiate the cells into mature brown and white adipocyte provides an attractive model to investigate human adipose metabolism in both normal physiologic and disease conditions, and may ultimately help to understand the role adipocytes play in human disease.

Humane pluripotente Stammzellen (hPSC) haben das Potential die biologische und medizinische Forschung zu revolutionieren. Zuvor müssen jedoch eine Reihe grundlegender Probleme gelöst werden. So sind die vorhandenen Kulturbedingungen ineffizient, unzuverlässig und aufwendig. Für viele wichtige Fragestellungen fehlen zudem geeignete Differenzierungsprotokolle, wodurch wichtige Zelltypen für Experimente nicht zur Verfügung stehen. Beispielsweise mangelt es an effektiven und robusten Strategien um Adipozyten in Zellkulturen herzustellen und zu kultivieren. Fettleibigkeit hat in den letzten Jahrzehnten epidemische Ausmaße in weiten Teilen der Bevölkerung erreicht, mit negativen Auswirkungen auf Gesundheit und Lebensqualität vieler Betroffenen. Ein wichtiger Faktor, für die mit Übergewicht assoziierten Stoffwechselerkrankungen, ist der Zustand von Adipozyten. Eine Methode die es ermöglicht funktionelle Adipozyten effizient in vitro zu kultivieren, würde die Untersuchung dieser Zellen im gesunden und pathologischen Zustand ermöglichen und könnte dadurch den Kampf gegen die Folgen der Fettleibigkeit unterstützen. Diese Doktorarbeit besteht aus zwei Teilen; der erste Teil bezieht sich auf die Entwicklung eines verbesserten Kultursystems von hPSCs, während der zweite Teil eine Methode zur Generierung von weißen und braunen Adipozyten aus Stammzellen vorstellt. Im ersten Teil der Arbeit demonstrieren wir, dass die sogenannte “enhanced culture platform” (ECP) geeignet für die Kultur von humanen Stammzellen ist. Zudem ermöglicht die Nutzung dieser Plattform Unzulänglichkeiten vorhandender Zellkultursysteme erheblich zu verbessern. Zum Beispiel wurden durch Optimierung der Kulturbedingungen, die Zellkultur sowohl effizienter gemacht und stabilisiert, als auch genetische Manipulation deutlich vereinfacht. Der zweite Teil der Arbeit hat die Entwicklung eines experimentellen Systems zur Differenzierung von hPSC in braune und weiße Adipozyten zum Thema. Dafür entwickelten wir eine Strategie die Zellen, mittels Überexpression ausgewählter Transkriptionsfaktoren, in bestimmte Zelltypen lenkt. Anhand einer Reihe von Untersuchungen auf morphologischer und molekularer Ebene folgerten wir, dass die Überexpression des adipozyten-spezifischen Transkriptionsfaktors PPARG2 ausreicht, um aus hPSC hergestellten mesodermalen Stammzellen effizient und robust vollständig ausgereifte weiße Fettzellen zu differenzieren. Die so generierten Adipozyten besitzen zudem für Fettzellen spezifische funktionelle Fähigkeiten: Sie können Lipolyse von Fettsäuren durchführen, neue Fettsäuren herstellen, Glukose nach Insulin-Stimulus aufnehmen und Adipokine freisetzen. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse die Identität und Funktionalität der Zellen und wir folgerten, dass wir erfolgreich ein in vitro System zur Herstellung von weißen Adipozyten entwickelt haben. Diese Resultate deuten zudem auf eine Eignung des Zellkultursystems für die Untersuchung des Einflusses von Adipozyten auf Krankheiten, wie zum Beispiel Fettleibigkeit, Lipodystrophie oder Diabetes mellitus Typ 2, hin. Braunes Fettgewebe ist in Säuglingen und kleinen Säugetieren zur Generierung von Körperwärme zuständig. Mit der Wärmeproduktion ist die Freisetzung großer Mengen metabolischer Energie verbunden. Aufgrund des möglicherweise erheblichen Einflusses auf den Energiehaushalt eines Lebewesens, hat die Entdeckung, dass auch erwachsene Menschen Depots aus braunem Fett besitzen, starkes Interesse ausgelöst. Als potenzieller Ansatzpunkt zur Bekämpfung von Adipositas könnte das Gewebe die Entwicklung neuartiger Medikamente ermöglichen. Für die Untersuchung von menschlichen braunen Adipozyten stand bisher jedoch kein in vitro Zellkultur Modell zur Verfügung und wenig ist bisher über diese Zellen im Menschen bekannt. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren PPARG2, CEBPB und PRDM16 untersucht, hPSCs in braune Adipozyten umzuwandeln. Wir konnten zeigen, dass die Kombinationen PPARG2/CEBPB und PPARG2/CEBPB/PRDM16 fähig waren, Zellen mit morphologische und molekulare Charakteristika von braunem Fettgewebe zu generieren. Wir analysierten die braunen Adipozyten und konnten zeigen, dass die Zellen gegenüber den programmierten weißen Adipozyten einen erhöhten Sauerstoffverbrauch besitzen, verstärkt extrazelluläre Acidität verursachen und vermehrt Glucose aufnehmen. Diese Ergebnisse deuten auf einen deutlich erhöhten Stoffwechsel der programmierten braunen Adipozyten hin, eine wichtige funktionelle Eigenschaft von braunem Fettgewebe in vivo. Um zu untersuchen, ob die aus hPSC generierten weißen und braunen Adipozyten die Fähigkeit haben, ihre entsprechenden Gewebetypen in vivo zu erzeugen, haben wir die Zellen in immun-kompromittierte Mäuse transplantiert. Nach 6 Wochen bildete sich aus den injizierten Zellen ein Fettpolster welches morphologische und molekulare Charakteristika der entsprechenden primären Zelltypen aufwies. Zudem sammelten sich in den transplantierten braunen Adipozyten, große Mengen an radioaktiv markierter Glukose an, ein weiterer Hinweis auf die erhöhte Stoffwechselrate der Zellen und ein eindeutiger Hinweis, dass es sich bei diesen Zellen um authentische braune Adipozyten handelt. Derzeit gibt es nur wenige wirksame Möglichkeiten, der Epidemie von Adipositas und den damit verbundenen Folgeerkrankungen, Einhalt gebieten zu können. Diese Doktorarbeit hat, durch die Einführung von Transkriptionsfaktor vermittelter Differenzierung von weißen und braunen Adipozyten und deren detaillierte Charakterisierung, einen wichtigen Beitrag zu dem Verständnis von Adipozyten geleistet. Die hier vorgestellten Methoden werden die Untersuchung der Rolle von Adipozyten in normalen und pathologischen Prozessen ermöglichen und können so die Entwicklung von Therapien gegen Fettsucht und damit assoziierten Folgeerkrankungen wie Diabetes mellitus, Schlaganfällen oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen unterstützen.