Ligand Receptor Interaction on Soft Scaffolds: the Influence of Young's Modulus, Ligand Concentration, and Type

Abstract

Ligand receptor interactions mediate a great number of biological events such as cell-cell communication, pathogen invasion, or cell growth. Thus it is of great interest to investigate ligand receptor interactions in order to gain a deeper knowledge about their biological function. Such information can then also be applied to derive new and optimized ligands e.g. to block natural ligand receptor interactions in therapeutical applications such as pathogen inhibition. Today, there already exists a great number of theoretical models as well as experimental methods to evaluate the binding of ligands and receptors e.g. in terms of their binding thermodynamics or binding affinities. However, most of these methods are focused on a single ligand receptor pair interaction, or completely dissolved ligand receptor systems. In nature, ligand receptor interactions often take place at soft interfaces such as the cell surface where not a single but assemblies of ligands and receptors interact simultaneously. Recently, a novel method, soft colloidal probe - reflection interference contrast microscopy (SCP-RICM), was developed to study ligand receptor interactions at soft interfaces. In this technique, poly (ethylene glycol) (PEG) based hydrogel microparticles are functionalized with ligands or receptors as a highly simplified model of the extracellular matrix. As counterpart, glass slides are functionalized with the corresponding receptors or ligands. Upon incubation of the SCPs on the glass slide, ligand receptor binding takes place leading to adhesion of the SCPs on the glass slide. As the SCPs are soft, they can deform to further maximize the contact area and thereby the ligand receptor interactions. Through analysis and read- out of the contact area with RICM and by applying a modified Hertzian elastic contact model, the Johnson, Kendall, and Roberts (JKR) model, the specific adhesion energy between ligands and receptors at the interface can be quantified. The aim of this work was to further develop the SCP-RICM method and apply the system to investigate ligand receptor interactions at soft, biomimetic interfaces. Specifically, there are three main aspects that were investigated in this work: I) the influence of mechanical properties or flexibility of the anchoring surface (Young’s modulus of SCP material), II) the influence of ligand concentration at the interface (degree of functionalization of SCPs), III) the influence of ligand type (weak vs. strong ligand receptor pairs) attached to the soft interface. In the first part, the synthesis of SCPs with different Young’s modulus was established. There are two approaches: I) By using a mixture of PEG-based macromonomers and crotonic acid during polymerization, the degree of cross-linking can be tuned and thus SPCs with different Young’s modulus in a range of 16 kPa to 319 kPa were obtained. II) As an alternative to PEG SCPs, PAA SCPs were synthesized through inverse suspension polymerization and the degree of cross-linking was controlled by the cross-linker/monomer ratio. The Young’s modulus of PAA SCPs were varied in a range of 7 kPa to 53 kPa. In the second part, the functionalization of SCPs with different ligands and controlling the degree of functionalization was investigated. PEG SCPs with various Young’s moduli were functionalized with crotonic acid via benzophenone photochemistry, and then further reacted with aminoethyl linked biotin and mannose via amide coupling. PEG SCPs with various Young’s moduli but similar degree of functionalization of mannose and biotin were obtained. This gave access to study the influence of mechanical properties and flexibility of the anchoring surface, as well as the influence of ligand type on ligand receptor interactions at biomimetic interfaces. PAA SCPs were functionalized with aminoethyl linked mannose via amide coupling and the degree of functionalization of mannose was varied by coupling mixtures of mannose ligand and non-ligand compound monoethanolamine (MEA) in a range of 0 mmol/g to 12.99 mmol/g. This gave access to study the influence of degree of functionalization of ligand on ligand receptor interactions at soft biomimetic interfaces. In the third part, influence of Young’s modulus, ligand concentration, and type were investigated through SCP- RICM experiments using the previously synthesized SCPs. Applying PAA-Man SCPs, it was found that higher ligand concentration leads to a higher overall adhesion energy. However, adhesion seems to reach a plateau when one of the binding partners (ligand or receptor) is saturated due to excess of the opposite binding partner. Investigating the adhesion of PEG-Man SCPs, it was found that higher Young’s moduli of SCPs lead to increased adhesion most likely due to entropic effects. However, for PEG-biotin SCPs no dependency on the Young’s modulus was observed. Potentially, here a cooperative binding of biotin on softer SCPs overcompensates for the loss of entropy in comparison to the harder SCPs. Cooperative binding in case of PEG-biotin was more likely compared to PEG Man SCPs due to the very large half-life of the biotin - avidin complex. In order to investigate these effects further, negatively charged PEG-CA SCPs were incubated on cationic polyelectrolyte surfaces. For such electrostatic interactions, it was found that higher Young’s moduli of SCPs lead to stronger adhesion for PEG-CA SCPs in presence of salt while this effect is reversed in water. In absence of salt, charged groups undergo long range interactions and only the softer SCPs allow for more charged groups to interact with the surface. For the same system in the presence of salt, charges are now screened and similar to the results for the mannose system, entropy favours the adhesion of less flexible SCPs. Overall, this thesis showed the Young’s modulus and ligand functionalization degree can be controlled for PEG and PAA SCPs. The influences of Young’s modulus, ligand concentration, and type on ligand receptor interaction were investigated. These new insights into ligand receptor interactions at soft interfaces will also promote the understanding of ligand receptor interactions in biological systems and to potentially design novel therapeutic strategies e.g. in antibacterial or anticancer therapy in the future.

Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen bilden die Grundlage für eine Vielzahl biologischer Prozesse wie zum Beispiel der Zell-Kommunikation, der Invasion durch Krankheitserreger oder dem Zellwachstum. Daher ist es von großem Interesse diese Wechselwirkungen zu untersuchen und das Wissen über ihre biologische Funktion zu vertiefen. Diese Erkenntnisse können bei der Entwicklung und Optimierung von neuartigen Liganden eingesetzt werden, um natürliche Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen wie zum Beispiel den Befall durch Krankheitserreger zu inhibieren. Es existieren sowohl eine Vielzahl von theoretischen Modellen, aber auch experimentelle Methoden, um die Wechselwirkung zwischen Liganden und Rezeptoren, zum Beispiel bezüglich der Thermodynamik oder Bindungsaffinitäten, zu untersuchen. Jedoch lassen diese Methoden häufig nur Aussagen über die Interaktion zwischen einzelnen Ligand- Rezeptor-Paaren oder vollständig in Lösung befindlichen Ligand-Rezeptor- Systemen zu In der Natur finden diese Wechselwirkungen jedoch sehr häufig an weichen Oberflächen wie beispielsweise an Zelloberflächen statt, wo nicht nur eine, sondern eine Vielzahl von Liganden und Rezeptoren gleichzeitig interagieren. Eine neuartige Methode, die sogenannte soft colloidal probe - reflection interference contrast microscopy (SCP-RICM), ermöglicht es, die Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptoren auf weichen, biomimemtischen Oberflächen zu untersuchen. Bei dieser Methode werden Mikrogele auf Basis von Polyethylenglycol (PEG) mit Liganden oder Rezeptoren funktionalisiert und dienen als stark vereinfachtes Modell der extrazelluären Matrix. Die korrespondierenden Liganden beziehungsweise Rezeptoren werden auf Glasoberflächen immobilisiert und bilden den Bindungspartner zur SCP. Nach Zugabe der SCPs auf die Glassoberfläche findet eine Bindung zwischen Liganden und Rezeptoren statt, welche zur Adhäsion der SCPs auf der Glasoberfläche führt. Da die SCPs weich sind, wird die Kontaktfläche durch die Deformation erhöht, in der die Liganden und Rezeptoren Wechselwirkungen eingehen. Durch die Analyse der Kontaktfläche mit dem von Johnson, Kendall und Roberts (JKR) modifizierten Modells der Kontaktmechanik, kann die spezifische Adhäsionsenergie zwischen Liganden und Rezeptoren an der Grenzfläche quantifiziert werden. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die SCP-RICM Methode weiterzuentwickeln und sie zur Untersuchung der folgenden Parameter von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen an weichen, biomimetischen Oberflächen anzuwenden: 1\. Der Einfluss der mechanischen Eigenschaften der verankernden Oberfläche (Elastizitätsmodul nach Young der SCPs) auf die Adhäsion. 2\. Der Einfluss der Ligandenkonzentration an der Grenzfläche (Funktionalisierungsgrad der SCPs) auf die Adhäsion. 3\. Der Einfluss der Art des Liganden (schwache bzw. starke Ligand-Rezeptor Paare), welche an den SCPs gebunden sind, auf die Adhäsion. Im ersten Teil der Arbeit wurde hierzu die Synthese von SCPs mit verschiedenen Elastizitätsmodulen (E-Modul) etabliert. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: I) Durch den Einsatz von Makromonomeren auf PEG-Basis und Zusatz von Crotonsäure während der Polymerisation, konnte der Vernetzungsgrad variiert werden, wodurch SCPs mit E-Modulen zwischen 16 kPa und 319 kPa synthetisiert wurden. II) Als Alternative zu PEG-SCPs wurden SCPs auf Basis von Polyacrylsäure (PAA) durch inverse Suspensionspolymerisation hergestellt. Der Vernetzungsgrad wurde durch das Verhältnis von Vernetzer zu Monomer kontrolliert. Das E Modul der PAA-SCPs konnte in einem Bereich von 7 kPa bis 53 kPa variiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktionalisierung der SCPs mit verschiedenen Liganden, sowie deren Funktionalisierungsgrad untersucht. PEG-SCPs mit verschiedenen E-Modulen wurden mittels Benzophenon-basierter Photochemie mit Crotonsäure funktionalisiert. Anschließend wurden Mannose und Biotin, nach vorheriger Modifizierung mit einer Aminoethyl-Gruppe, durch eine Amidkupplung kovalent an die SCPs gebunden. Dadurch wurden PEG-SCPs mit verschiedenen E-Modulen, aber dem gleichen Funktionalisierungsgrad erhalten. Auf dieser Grundlage konnte der Einfluss der mechanischen Eigenschaften oder der Flexibilität der verankernden Oberfläche, sowie der Einfluss der Art des Liganden auf die Ligand-Rezeptor- Wechselwirkungen an weichen Oberflächen untersucht werden. PAA-SCPs wurden mit Aminoethyl-Mannose durch eine Amidkupplung funktionalisiert, wobei der Funktionalisierungsgrad der Mannose durch die Zugabe von verschiedenen Mengen (0 mmol/g bis 12,99 mmol/g) Monoethanolamine (MEA) zur Reaktionslösung variiert wurde. Mit Hilfe der so erhaltenen PAA-SCPs konnte der Einfluss des Funktionalisierungsgrades auf die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen an weichen, biomimetischen Oberflächen untersucht werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden der Einfluss des E-Moduls, der Ligandenkonzentration und Art des Liganden mittels SCP-RICM untersucht. Am Beispiel der PAA-SCPs konnte gezeigt werden, dass eine höhere Ligandenkonzentration eine größere Adhäsionsenergie zur Folge hat. Allerdings scheint die Adhäsion ein Plateau zu erreichen, sobald die Sättigung eines Bindungspartners (Ligand oder Rezeptor) durch einen Überschuss des gegenteiligen Bindungspartners erreicht ist. Bei der Untersuchung der Adhäsion der PEG-Man-SCPs konnte beobachtet werden, dass ein größeres E-Modul der SCPs zu einer höheren Adhäsion führt, was mutmaßlich auf entropische Effekte zurückzuführen ist. Für die PEG-Biotin SCPs konnte kein Einfluss des E-Moduls beobachtet werden. Es ist möglich, dass eine kooperative Bindung von Biotin auf weicheren SCPs die entropischen Effekte auf härteren SCPs überkompensiert. Im Fall der Biotin-SCPs sind kooperative Bindungen wahrscheinlich, da der Biotin / Avidin-Komplex eine sehr hohe Halbwertszeit aufweist. Um diesen Effekt tiefergehend zu untersuchen, wurden anionisch geladene PEG-CA SCPs auf einer kationischen Oberfläche inkubiert. Bezüglich der elektrostatischen Wechselwirkungen konnte festgestellt werden, dass ein größeres E-Modul zu einer stärkeren Adhäsion für PEG-CA SCPs in Anwesenheit von Salz führt, während der umgekehrte Effekt ohne Salz beobachtet wurde. Ohne Zusatz von Salz gehen die geladenen Gruppen weitreichende Wechselwirkungen ein und lediglich weichere SCPs ermöglichen es, dass mehrere Gruppen an der Oberfläche interagieren. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass das E-Modul und der Funktionalisierungsgrad der Liganden bei PEG und PAA SCPs kontrolliert werden kann. Mit Hilfe der so erhaltenen Modellsysteme wurde dann der Einfluss des E-Moduls, der Ligandenkonzentration und der Art des Liganden bei Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen an weichen Oberflächen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass alle drei Parameter Ligand-Rezeptor vermittelte Adhäsion beeinflussen und insbesondere die Art des Liganden und der Einfluss des E-Moduls eng miteinander verknüpft sind. Diese neuen Erkenntnisse bezüglich Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen an weichen Oberflächen ermöglichen somit potenziell neuer Erkenntnis auch in biologischen Systemen und könnten bei der Entwicklung neuartiger Therapiemethoden z.B. antibakterieller Therapien helfen.