Entwicklung eines coiled coil-basierten Screeningsystems zur Bestimmung spezifischer Wechselwirkungspartner fluoralkylsubstituierter Aminosäuren

Abstract

Fluorierte Aminosäuren stellen wertvolle Bausteine für die Konstruktion neuartiger Peptid- und Proteinstrukturen dar. Die einzigartigen Eigenschaften des Fluoratoms sowie das Fehlen dieses Elements im Pool der kanonischen Aminosäuren erlauben eine Vielzahl interessanter Anwendungen dieser Moleküle. Die häufig beobachtete Erhöhung der Proteasestabilität von Peptiden infolge des Einbaus fluorierter Aminosäuren sowie die höhere Hydrophobie und der damit verbundene Anstieg der Membranpermeabilität machen diese Verbindungen zu attraktiven Bausteinen für die Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe. Allerdings sind die Möglichkeiten des gezielten Einsatzes fluorierter Aminosäuren für das Design peptidbasierter Wirkstoffe aufgrund der nach wie vor lückenhaften Kenntnisse bezüglich ihrer biologischen Eigenschaften stark eingeschränkt. Besonders die Wechselwirkungsmöglichkeiten mit natürlichen Aminosäuren in einer nativen Proteinumgebung sind bisher nur wenig untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein paralleles coiled coil-Heterodimer entworfen, welches die Untersuchung des Wechselwirkungsverhaltens fluorierter Aminosäuren innerhalb einer natürlichen Proteinumgebung erlaubt. Ausgehend von diesem Peptidmodell wurde ein Phage Display-basiertes Screeningsystem entwickelt, um die bevorzugten Wechsel-wirkungspartner fluorierter Aminosäuren zu bestimmen und detaillierte Informationen über die Interaktionsmöglichkeiten dieser Reste zu erhalten. Hierfür wurden die zu untersuchenden nicht- natürlichen Aminosäuren in einen Peptidstrang (Screeningpeptid) des Modellsystems eingebaut, während im gegenüberliegenden Peptidstrang (Bibliothekspeptid) die direkt mit der substituierten Aminosäure wechselwirkenden Aminosäurepositionen randomisiert wurden. Nachdem die Bindung zwischen dem Screeningpeptid und dem auf der Phagenoberfläche präsentierten Bibliothekspeptid gezeigt werden konnte, wurden auf Grundlage der coiled coil- Wechselwirkung aus der Bibliothek die besten Bindungspartner für das Screeningpeptid isoliert. Das entwickelte Verfahren wurde an verschiedenen kanonischen Aminosäuren erfolgreich getestet und schließlich für die Bestimmung bevorzugter Wechselwirkungspartner fluorierter Aminosäuren angewendet. Untersucht wurden dabei die bereits zuvor in der Arbeitsgruppe von Prof. Koksch verwendeten Aminosäuren Difluorethylglycin, Difluorpropylglycin und Trifluorethylglycin. Obwohl diese Aminosäuren deutliche Unterschiede in Raumanspruch und Polarität aufweisen, konnte gezeigt werden, dass diese in den untersuchten Substitutionspositionen die gleichen Wechselwirkungspartner bevorzugen wie die natürlichen hydrophoben Aminosäuren Leucin bzw. Valin.

Fluorinated amino acids represent useful building blocks for the construction of novel peptide and protein structures. The unique properties of fluorine and its absence from the pool of canonical amino acids offer a wide range of applications. Due to the observation that fluorinated amino acids often enhance the proteolytic stability as well as the hydrophobicity and membrane permeability of peptides, these building blocks are interesting tools for drug design. However, the directed application of fluorinated amino acids in the development of peptide based drugs is limited by the narrow knowledge of the biological properties of fluorinated building blocks. Particularly, the interactions with natural amino acids within a native protein environment are poorly investigated. In this thesis a parallel coiled coil heterodimer was designed, which enables the investigation of the interaction properties of fluorinated amino acids within a native protein environment. Based on this model a phage display based screening system was developed to determine preferred interaction partners of fluorinated amino acids and to achieve detailed information of possible interactions of these residues. Accordingly, the non canonic amino acids were incorporated at a central a- or d-position of one of both peptide strands (screening peptide) while in the opposite peptide (library peptide) the positions which directly interact with the substituted amino acids were randomized. Binding between screening peptide and the library peptide displayed on the surface of bacteriaphage M13 was shown and a peptide library of sufficient size was constructed. Based on the coiled coil interaction the best binding partners for the screening peptide were selected out of the pool of potential interaction partners. First, the selection strategy was tested and optimized using the unsubstituted screening peptide. The sensitivity of the selection procedure was successfully tested using different canonical amino acids and the procedure was applied to the selection of preferred interaction partners of fluorinated amino acids. Thereby, difluoroethylglycine, difluoropropylglycine and trifluorglycine, which were used in the group of Professor Koksch before, were investigated. However, even though significant differences in steric demand and polarity were shown for these amino acids before, no differences regarding preferred interaction partners were observed. Incorporated within the hydrophobic core of a α-helical coiled coil, the fluorinated amino acids investigated in this thesis prefere the same binding partners as native hydrophobic amino acids such as leucine and valine which naturally occur in these positions.