Analysis of drug substances by using new concepts of HPLC and development of some HPTLC methods

Abstract

Antibiotics and anti-inflammatory drugs are two main categories which are widely used in treatment of different diseases. That is why pharmaceutical analysts are trying to develop different analytical methods for their determination. The Pharmacopoeias are the main source to get the analysis methods of most of the official drugs. Therefore Pharm. Eur. was selected to get the official quantitative and qualitative method of analysis Some representative drugs were chosen for the study in this thesis. Spiramycin, Doxcyclin, Clindamycin and Roxithromycin were examples for antibiotics. For anti-inflammatory drugs, Etodolac and Troxerutin were the selected examples. According to the Pharm. Eur., HPLC and TLC techniques were the official analytical methods for assay, identification and purity test for these drugs. Through the literature of the official and nonofficial HPLC analysis of all these drugs, conventional HPLC column was the only stationary phase which used for their analysis. There are many disadvantages for the use of that type of columns such as long analysis time. To the best of our knowledge there is no reported UPLC-like method for any of these drugs. UPLC is a new type of fast HPLC technique which characterised by the short analysis time. Therefore it was important to transfer these official HPLC methods to UPLC-like method by the use of new analytical columns which packed with more advanced stationary phases such as monolithic and fused core columns. Moreover comparisons were established among all selected stationary phases in terms of chromatographic run time, different flow rates, the produced column back pressure, different types of elution (gradient and isocratic), different mobile system composition, and different sample solvents. Performance parameters as AF, Rs and the theoretical plate number were also studied. The validation parameters (linearity, precession, LOD, LOQ, robustness, reproducibility) were therefore examined for the optimum conditions in each case. The aim of the work was to get the most suitable chromatographic method which can be used instead of the official HPLC method without affecting the resolution of peaks, sensitivity of the method or all validation parameters. Very short analysis time was obtained with all developed methods by using modern columns. For example, the official chromatographic run time for the analysis of CLD was (12 min) and on its transfer to UPLC-like method the analysis time was reduced to (2 min), for SPR the run time reduced from official method (40 min) to developed method (5 min), while for ROX run time was very long with official method (100 min) but by new developed method the run time was only (5 min). Validation parameters were tested for all developed methods as Precision. The within-day repeatability was in the range (0.52- 0.88%) with conventional column and (0.41- 0.87%) with the modern columns. Furthermore, the between-days repeatability was in the ra nge (0.66 –1.25%) with conventional and (0.50 – 0.96%) with modern columns. Modern columns gave more precise integration than that of the conventional columns which can be attributed to the better peak shape and reduced baseline noise. In fact, peak tailing in RP HPLC is particularly prevalent when separating basic compounds. It causes a number of problems including lower Rs, reduced sensitivity and poor precision and quantitation. However symmetric peaks were obtained with the other used stationary phases. The highest AF value was obtained with the use of conventional stationary phase. For example, for Pharm. Eur. Analysis of ETD, CLD or SPR, the obtained AF was 1.4, 1.4 and 1.5 respectively. However, with the developed UPLC-like methods AF was reduced to (1.0 – 1.1) by using fused core and monolithic columns respectively. In the official HPLC methods of some of the selected drugs, the used temperature was not suitable for our lab work. For example, in ROX or DOX official analysis, the temperature were 15 °C and 60°C respectively. However in the developed methods, an ambient temperature was the optimum for the analysis. Moreover, ROX was efficiently separated from its other components in the concentrated sample by the applying the developed method. Acceptable resolution values were obtained with all developed methods. ETD analysis as a representative example, poor separation of ETD from its impurity CON was observed on applying the official method and the obtained Rs was (Rs < 1). On the other hand, on applying the developed gradient elution method, the Rs was raised to (Rs=2.5). Also, a developed UPLC-like method with isocratic elution system for analysis of ETD and its impurity, the Rs values were 1.4, 2.5 and 3.6 by using luna, monolithic and fused core columns respectively. The developed methods were sensitive with low LOD and LOQ. For example, the LOD and LOQ in the analysis of ETD by official method were 0.15 and 0.5 µg/ml respectively, while with the developed method LOD values were reduced to 6, 3.8, 3.3 and 3 ng/ml was by using conventional, luna, monolithic and fused core columns respectively. Also, the LOQ values were reduced to 20, 11.2, 14, and 10 ng/ml by using conventional, luna, monolithic and fused core column respectively. In the analysis of CLD by the official method, the LOD and LOQ values were 61 and 200 ng/ml respectively. However, on transferring to UPLC-like method the LOD values were reduced to 13, 12 and 11 ng/ml by using luna, monolithic and fused core columns respectively. LOQ values were reduced as well to 47, 40 and 38 ng/ml by using luna, monolithic and fused core columns respectively. The low LOD and LOQ values which obtained with the use of monolithic and fused core columns can be attributed to the obtained low background noise. The obtained column backpressure readings were watched. For example, with CLD assay, the flow rate was 1ml/min with column lenght (50 mm), the column backpressure readings were 16, 20, 74, 225 bar by using monolithic, conventional, fused core and luna respectively. Generally higher backpressure resulted with the use of luna because of the small particle size (2.5 µm dp). On using fused core column the backpressure was reduced which attributed to the new technology in particles (2.7 µm) with a high-capacity and very pure porous silica layer which fused to a solid silica core. Monolithic column showed the lowest backpressure reading due to the high permeability of its bimodal structure. For some of the selected drugs “Etodolac, Spiramycin and Troxerutin”, it was found that the official TLC methods were not able to get efficient separation of the drug and its impurities spots. Therefore developments of new TLC methods with the use of horizontal developing chamber were studied. TLC mobile phase and the used sample solvent were optimized. In TRX, The decrease in polarity of the sample solvent showed better results. With the other drugs (SPR and ETD), phosphomolibdic acid reagent was used as new derivatizing reagent with clear background of plate. That gave better detection of the analyte spots rather than using UV lamp detection only which was used in the official TLC method for ETD and anisaldhyde reagent for SPR. In the official TLC purity test of Etodolac there are two different mobile phases with two drying steps were used which time and cost are consuming. One hour analysis time was consumed for the official method procedure. On the other hand, in developed method, the analysis time was reduced to 3 and 1.5 min by using TLC and HPTLC plates respectively, with toluene and acetone in the ratio 1:1 v/v as a mobile system. The developed methods were effective to separate CON and ETD by using TLC and HPTLC plates. The measured TLC Rf values 0.54 and 0.60 for ETD and CON respectively. On the other hand, HPTLC Rf values were 0.54 and 0.67 for ETD and CON respectively. No separation of components of SPR sample was observed by applying official TLC method with 22 min analysis time. However, seven different spots (which related to SI, II, III and other four components in the same sample mixture) were observed by using the developed method and the analysis time was reduced to 3 and 2 min by using TLC and HPTLC plates respectively. According to DAB 1999 procedure, TRX was analysed by TLC methods. Poor shaped spots were observed with Rf values 0.22 and 0.08 for the main spot and blue spot respectively which are less than normal Rf range. That may be due to a poor resolution and separation of the TRX components. By reducing the sample solvent polarity and increasing of the polarity of mobile system, the Rf values and the shape of the separated spots were improved. The obtained Rf values were 0.43 and 0.24 for the main spot and blue spot respectively to be within the expected ranges of DAB, and the developing time was 4 and 2 min by using TLC and HPTLC plates respectively. However, the developed method with using concentrated sample was able to separate the minor compound. The developed TLC method for analysis of SPR was applied to preparative TLC. The developed bands were scratched, extracted and analyzed with HPLC for comparison and confirmation. The obtained results were matched. By using new developed HPLC method with isocratic elution system for ETD analysis with different types of columns and the run time was 2 min. The method was efficient to separate 0.03 µg of CON/ ml of ETD sample in a concentration 0.003 mg/ml. However, the developed TLC and HPTLC methods were also efficient to separate CON from ETD but in 0.05 mg of CON/ml of ETD sample (1mg/ml) within 3 and 1.5 min developing times respectively. By using the UPLC- like method for the analysis of SPR (0.25 mg/ml) at F= 0.8 ml/min, many peaks were observed within 5 min run time. On the other hand, by applying the developed TLC and HPTLC methods, seven different spots were developed with SPR (4 mg/ml) within 3 and 2 min developing times respectively. In all examined official HPLC and TLC methods a significant improvement could be obtained by using UPLC-like methods and optimized conditions of HPTLC methods respectively.

Antibiotika und entzündungshemmende Arzneistoffe sind zwei Substanzklassen, die in der Behandlung der verschiedensten Krankheiten am meisten verschrieben werden. Das Bestreben der pharmazeutischen Analytiker ist es daher, verschiedene analytische Methoden für ihre Untersuchung zu entwickeln. Die Arzneibücher sind die Hauptquelle, um sich über die Analysenmethoden der meisten zugelassenen Arzneistoffe zu informieren. Folglich wurde Pharm. Eur. gewählt, um die vorgeschriebenen quantitativen und qualitativen Analyseverfahren anzuwenden. In dieser Doktorarbeit wurden einige repräsentative Arzneistoffe gewählt. So waren Spiramycin, Doxcyclin, Clindamycin und Roxithromycin Beispiele für Antibiotika. Testsubstanzen für entzündungshemmende Arzneistoffe waren Etodolac und Troxerutin. Entsprechend der Pharm. Eur. waren HPLC- und DC-Techniken die gängigen analytischen Methoden zur Identitäts- und Reinheitsprüfung dieser Substanzen. In der Literatur ist die HPLC-Analyse all dieser Arzneistoffe mit konventionellen HPLC-Säulen als einzige stationäre Phase durchgeführt worden. Es resultieren jedoch zahlreiche Nachteile beim Gebrauch dieser Art von Säulen, wie z.B. die lange Analysenzeit. Nach bestem Wissen wurden keine UPLC-ähnlichen Methoden einer dieser Drogen veröffentlicht. Die UPLC ist eine schnelle HPLC-Technik, die sich in ihrer kurzen Analysenzeit wiederspiegelt. Folglich war es wichtig, diese gängigen HPLC-Methoden auf UPLC-ähnliche Methoden unter Anwendung von neuen analytischen Säulen zu bringen, die mit neuartigen stationären Phasen gepackt sind, wie z.B. die monolithischen Säulen und die Fused Core-Säulen. Außerdem wurden Vergleiche unter allen ausgewählten stationären Phasen hinsichtlich der chromatographischen Laufzeit, der verschiedenen Fließgeschwindigkeiten, dem produzierten Rückstau der Säule, den verschiedenen Arten der Eluierung (Gradienteneluierung und isokratische Eluierung), dem unterschiedlichen Aufbau des beweglichen Systems und der verschiedenen Lösungsmittel gemacht. Verschiedene Leistungsparameter wie AF, Rs und die Zahl der theoretischen Böden wurden auch untersucht. Die Validierung (Linearität, Präzision, LOD, LOQ, Robustheit, Reproduzierbarkeit) wurde für jeden Fall mit den optimalen Bedingungen überprüft. Das Ziel der Arbeit war es, die beste chromatographische Methode zu finden, die anstelle der vorgeschriebenen HPLC- Methoden angewendet werden kann, ohne die Auflösung der Peaks, die Empfindlichkeit der Methode oder die Validierungsparameter zu beeinflussen. Sehr kurze Analysenzeiten wurde mit allen weiterentwickelten Methoden erhalten, indem man moderne Säulen verwendete. So wurde die chromatographische Laufzeit für die Analyse von CLD (12 Minuten) durch Anwendung UPLC-ähnlicher Methoden auf eine Analysenzeit von 2 Minuten gebracht, während die Laufzeit von SPR von 40 Minuten auf 5 Minuten verringert wurde. Bei ROX war die Laufzeit nach Pharm. Eur. sehr lang (100 Minuten), durch die neu entwickelte Methode betrug die Laufzeit lediglich 5 Minuten. Die Validierungsparameter wurden für alle entwickelten Methoden überprüft. Die Wiederholpräzision lag mit konventionellen Säulen im Bereich von 0.52 - 0.88 % und von 0.41 - 0.87 % mit modernen Säulen. Außerdem lag die Tag-zu-Tag-Präzision im Bereich von 0.66 - 1.25 % mit konventionellen und von 0.50 - 0.96 % mit modernen Säulen. Moderne Säulen gaben eine präzisere Integration als konventionellen Säulen. Durch ihnen erhielt man eine bessere Peakform und geringeres Grundlinienrauschen. Das Peaktailing überwiegt in der RP HPLC in der Tat, wenn man einige Verbindungen trennt. Man hat hierbei Probleme hinsichtlich eines niedrigeren Rs, einer verringerten Empfindlichkeit, einer geringen Präzision und der quantitativen Bestimmung. Jedoch wurden symmetrische Peaks mit den hier verwendeten stationären Phasen erreicht. Der höchste AF-Wert wurde beim Gebrauch von konventionellen stationären Phasen erhalten. So wurden z.B. für die Analyse von ETD, CLD und SPR nach Pharm. Eur. folgende AF-Werte erreicht: 1.4, 1.4 und 1.5. Jedoch wurde bei der Entwicklung UPLC-ähnlicher Methoden, d.h. durch die Anwendung der Fused-Core-Säulen beziehungsweise der monolithischen Säulen, der AF-Wert auf 1.0 - 1.1 verringert. In den vorgeschriebenen HPLC-Methoden einiger Arzneistoffe war die verwendete Temperatur nicht für unsere Laborarbeit verwendbar. So wurden z.B. ROX und DOX nach Pharm.Eur. bei einer Temperatur von 15°C bzw. 60°C analysiert. In den entwickelten Methoden war die Raumtemperatur optimal für die Analyse. Außerdem konnte ROX in der hochkonzentrierten Probe effizient von seinen anderen Bestandteilen durch das Anwenden der entwickelten Methode getrennt werden. Mit allen entwickelten Methoden konnten akzeptable Auflösungen erreicht werden. So wird bei der Analyse von ETD nach Pharm. Eur. eine schlechte Trennung von seiner Verunreinigung CON erreicht. Der Rs-Wert beträgt lediglich Rs < 1\. Bei Anwendung der weiterentwickelten Methode der Gradienteneluierung konnte der Rs-Wert erhöht werden (Rs=2.5). Auch die entwickelte UPLC-ähnliche Methode mit isokratischer Eluierung ergab bei der Analyse von ETD und seiner Verunreinigung bessere Rs-Werte. Bei Verwendung der Luna-, monolithischen und Fused-Core-Säulen betrugen diese 1.4, 2.5 und 3.6. Die entwickelten Methoden hatten niedrige LOD- und LOQ-Werte. So betragen die LOD- und die LOQ-Werte bei der Analyse von ETD nach Pharm.Eur. 0.15 und 0.5 µg/ml, während mit der entwickelten Methode die LOD-Werte verringert wurden und bei 6, 3.8, 3.3 und 3 ng/ml lagen (bei der Anwendung konventioneller, Luna-, monolithischer und Fused-Core-Säulen). Auch die LOQ-Werte wurden auf 20, 11.2, 14 und 10 ng/ml durch die Anwendung konventioneller, Luna-, monolithischer und Fused-Core- Säulen verringert. Bei der Analyse von CLD nach Pharm.Eur. betrugen die LOD- und LOQ-Werte 61 bzw. 200 ng/ml. Bei Anwendung UPLC-ähnlicher Methoden wurden die LOD-Werte auf 13, 12 und 11 ng/ml durch die Anwendung der Luna-, der monolithischen sowie der Fused-Core-Säulen verringert. Außerdem konnten die LOQ-Werte auf 47, 40 und 38 ng/ml gebracht werden. Die niedrigen LOD- und LOQ- Werte, die beim Gebrauch monolithischer und Fused-Core-Säulen erreicht werden konnten, können dem niedrigen Grundrauschen zugeschrieben werden. Die erhaltenen Rückstauwerte wurden beobachtet. So wurde bei der Analyse von CLD bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1ml/min und einer Säulenlänge von 50 Millimeter folgende Werte erhalten: 16, 20, 74, 225 bar (beim Gebrauch monolithischer, konventioneller, Fused-Core-und Luna-Säulen). Generell erhielt man wegen der Teilchengröße (2.5 µm DP) einen höheren Rückstau beim Gebrauch von Luna-Säulen. Bei Verwendung von Fused-Core-Säulen wurde der Rückstau verringert, welches der neuen Technologie der Partikeln (µm 2.7) aufgrund ihrer hohen Kapazität und der sehr reinen porösen Silikonschicht zu verdanken ist, die zu einem festen Silikonkern verschmilzt. Die monolithische Säule führte zum niedrigsten Rückstau aufgrund der hohen Permeabilität seiner bimodalen Struktur. Bei den Arzneistoffen Etodolac, Spiramycin und Troxerutin wurde gefunden, dass sich die in Pharm.Eur. vorgeschriebenen DC-Methoden als nicht sinnvoll erwiesen, da es nicht möglich war eine leistungsfähige Trennung der Arzneistoff und seiner Verunreinigungen zu erhalten. Folglich wurden neue DC-Methoden durch den Gebrauch von horizontalen Kammern studiert. Hier wurden die mobile Phase und das Lösungmittel der Probe optimiert. Bei TRX beobachtete man bessere Resultate bei abnehmender Polarität des Lösungsmittels. Mit den anderen Arzneistoffen (SPR und ETD) wurde Molybdatophosphorsäure als neues derivatisierendes Reagens für einen klaren Hintergrund der Platte benutzt. Dies führte zu besserer Detektion der Analytpunkte als unter Verwendung der UV-Lampendetektion, die in Pharm.Eur. für ETD und für das Anisaldhyd-Reagens für SPR verwendet wird. Bei der Reinheitsprüfung von Etodolac gibt es nach Pharm.Eur. zwei verschiedene mobile Phasen, die zuvor getrocknet werden müssen, so dass dies zeit- und kostenraubend ist. Die Analysenzeit beträgt hier eine Stunde. Durch den Gebrauch von DC-und HPDC Platten (mit Toluol und Aceton im Verhältnis-1:1 v/v als mobile Phase) in unserer weiterentwickelten Methode konnte die Analysenzeit enorm verringert werden auf Werte von 3 und 1.5 Minuten. Die entwickelten Methoden waren wirkungsvoll, um CON und ETD voneinander zu trennen, indem man DC-und HPDC Platten verwendete. Die gemessenen DC Rf -Werte betrugen 0.54 und 0.60 für ETD bzw. CON. Die erhaltenen HPDC Rf -Werte betrugen 0.54 und 0.67 für ETD und CON. Es wird keine Trennung in die Bestandteile der SPR-Probe beobachtet, wenn man die im Pharm. Eur. vorgeschriebene DC-Methode mit einer Analysenzeit von 22 Minuten anwendet. Jedoch wurden sieben verschiedene Punkte bei Anwendung der weiterentwickelten Methode beobachtet, die zu SI, II, III und anderen vier Bestandteilen in der gleichen Probenmischung gehören. Die Analysenzeit konnte auf 3 (DC) bzw. 2 (HPDC) Minuten verringert werden. Entsprechend dem DAB 1999 wurde TRX mit DC analysiert. Man erhielt schwach ausgebildete Punkte mit Rf -Werten von 0.22 für den Hauptpunkt und 0.08 für den blauen Punkt. Die unüblich geringen Rf -Werte resultieren wahrscheinlich von der schwachen Auflösung und Trennung der TRX-Komponenten. Durch Verringerung der Polarität des Lösungsmittels und Erhöhung der Polarität der mobilen Phase wurden die Rf -Werte und die Form der getrennten Punkte verbessert. Die erhaltenen Rf-Werte waren 0.43 für den Hauptpunkt und 0.24 für den blauen Punkt und liegen somit innerhalb des erwarteten Bereichs des DAB. Die Analysenzeit betrug hier 4 Minuten für DC- und 2 Minuten für HPDC-Platten. Mit der weiterentwickelten Methode konnte bei Verwendung der konzentrierten Probe das Nebenprodukt vom Hauptprodukt getrennt werden. Die entwickelte DC-Methode wurde für die Analyse von SPR für die präparative DC angewendet. Die entwickelten Spots wurden ausgekratzt, extrahiert und mit Hilfe der HPLC zum Vergleich und zum Nachweis analysiert. Die erzielten Resultate wurden für die ETD-Analyse bei Anwendung der neu entwickelten HPLC-Methode mit isokratischer Eluierung und verschiedenen Arten von Säulen gezeigt (Laufzeit 2 Min.). Mit dieser Methode war es möglich 0.03 µg CON pro ml von der ETD Probe der Konzentration 0.003 mg/ml zu trennen. Mit den entwickelten DC-und HPDC-Methoden war es auch möglich CON von ETD zu trennen, jedoch in höherer Konzentration (0.05 mg CON/ml der ETD Probe (1mg/ml) innerhalb von 3 bzw. 1.5 Minuten). Bei Verwendung UPLC-ähnlicher Methoden konnten für die Analyse von SPR (0.25 mg/ml) bei F= 0.8 ml/min viele Peaks innerhalb einer Laufzeit von 5 Minuten beobachtet werden. Währenddessen konnte bei Anwendung der weiterentwickelten DC-und HPDC Methoden sieben verschiedene Punkte beobachtet werden, wobei SPR (4 mg/ml) innerhalb von 3 bzw. 2 Minuten analysiert wurde. Bei allen überprüften im Pharm.Eur. vorgeschriebenen HPLC- und DC-Methoden konnte eine deutliche Verbesserung erzielt werden, indem man UPLC-ähnliche Methoden und optimierte Bedingungen der HPDC-Methoden anwendete.