dc.contributor.author
Schreier, Juliane
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:10:11Z
dc.date.available
2013-09-03T08:49:32.638Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10135
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14333
dc.description.abstract
Protein kinase C epsilon (PKCɛ) is an intracellular signaling protein
activated in conditions associated with strong cellular stress such as
ischemia, cancer, and inflammation. PKCɛ is activated within seconds and
mediates rapid short-term effects but also effects lasting for hours and
weeks. How acute activation transforms to long-lasting effects cannot be
explained on the basis of the currently known PKCɛ substrates. In a PKCɛ
substrate candidate screen, we identified several new PKCɛ substrates, which
are known to be involved in protein translation, a process PKCɛ has so far not
been associated with. The modulation of translation may represent a mechanism
underlying the transition from acute to long-lasting effects. Thus, the aim of
this work was to investigate if PKCɛ has a yet unrecognized role in stress
responses and protein translation. I focused on the role of PKCɛ in two
subcellular structures, stress granules and P-bodies. Both cytoplasmic
structures are vital for the modulation of protein translation in response to
stress. I found that PKCɛ and its adaptor proteins RACK1 and RACK2 are
recruited to stress granules and P-bodies in F-11, HeLa, and HEK293T cells. To
investigate the function of PKCɛ for the formation of these RNA granules, I
performed siRNA knockdown studies and blocked the activity of PKCɛ with
pharmacological inhibitors. For data acquisition an automated “High Content
Screening” microscopy approach was established, which allowed the
quantification of granule formation at the single cell level. PKCɛ down-
regulation as well as inhibition increased the number of stress granules. PKCɛ
down-regulation also induced P-body formation, but acute PKC inhibition did
not alter P-body formation. The increase of RNA-granules suggests a decrease
of free and translatable mRNAs. Accordingly, I found decreased protein
translation upon PKCɛ knockdown using a fluorescence-based method to visualize
newly translated proteins (FUNCAT). Furthermore, I found evidence that the
recruitment of signaling molecules to translation modifying granules appears
to be a more general phenomenon. In addition to PKCɛ, a member of the family
of “novel PKCs”, I found classical PKCs to be involved in granule formation as
well. In addition to PKCs, I also observed the RII alpha subunit of protein
kinase A (PKA) to be recruited to stress granules and P-bodies in response to
cell stress. Thus, my data reveal a novel function of PKCɛ for the formation
of RNA granules, which results in altered protein translation. My data
therefore open the way to investigate, to what extend PKCɛ and PKA recruitment
to cytoplasmic RNA granules serves a similar function for stress responses, as
well as to what extend translation regulation can explain the transition from
acute activation to long-lasting effects.
de
dc.description.abstract
Die Proteinkinase C epsilon (PKCɛ) ist ein intrazelluläres Signalprotein,
welches unter starkem zellulärem Stress wie z.B. Ischemie, Krebs oder auch bei
Entzündungsprozessen aktiviert wird. Die Aktivierung von PKCɛ geschieht
innerhalb weniger Sekunden und vermittelt neben kurzfristigen Effekten auch
Effekte, die Stunden oder gar Wochen anhalten. Wie genau es zu dem Übergang
von akuter Aktivierung zu langanhaltenden Effekten kommt, lässt sich basierend
auf den bisher bekannten PKCɛ-Substraten nicht erklären. In einer groß
angelegten Untersuchung zur Identifizierung von PKCɛ-Substratkandidaten, die
in unserem Labor durchgeführt wurde, fanden wir einen großen Anteil an
Proteinen, die in die Proteintranslation involviert sind. Jedoch wurde PKCɛ im
Prozess der Proteintranslation bisher nicht beschrieben. Die Modulierung der
Proteinexpression könnte ein Mechanismus sein, der den Übergang von akuten zu
lang anhaltenden Effekten erklärt. Daher war das Ziel dieser Arbeit, zu
untersuchen, ob PKCɛ eine bisher unerkannte Funktion innerhalb der
Stressantwort und der Proteintranslation erfüllt. Ich konzentrierte mich auf
die Rolle der PKCɛ in zwei subzellulären Strukturen, den sogenannten Stress
granules und P-bodies. Beide zytoplasmatische Strukturen sind wesentlich an
der Modulierung der Proteintranslation als Stressantwort beteiligt. Ich fand
heraus, dass in F-11-, HeLa- und HEK293T-Zellen sowohl PKCɛ als auch ihre
Adapterproteine RACK1 und RACK2 zu Stress granules und P-bodies rekrutiert
werden. Um die Funktion der PKCɛ in diesen RNA-Strukturen zu untersuchen,
reduzierte ich die zelluläre Verfügbarkeit der PKCɛ mittels siRNA basierter
Herunterregulierung oder pharmakologischer Inhibierung. Zur Datengewinnung
wurde ein automatisches „High Content Screening“-Mikroskopie-Konzept
etabliert, das die Quantifizierung der granules auf Einzelzellniveau
ermöglichte. Sowohl die Herunterregulierung der PKCɛ, als auch ihre
Inhibierung erhöhte die Zahl der Stress granules. PKCɛ-Herunterregulierung
erhöhte ebenfalls die Zahl der P-bodies, jedoch beeinflusste zumindest die
akute PKC-Aktivierung die Bildung der P-bodies nicht. Die Erhöhung der RNA-
granules suggeriert einen Abfall freier und translatierbarer mRNA.
Dementsprechend fand ich, mit Hilfe der Durchführung einer
fluoreszenzbasierten Methode zur Visualisierung neu translatierter Proteine
(FUNCAT), eine Abnahme neu synthetisierter Proteine nach PKCɛ-
Herunterregulierung. Des Weiteren fand ich Belege dafür, dass die Rekrutierung
zu translationsmodifizierenden granules ein generelles Phänomen zu sein
scheint. Ich konnte zeigen, dass neben PKCɛ, einem Mitglied der „neuen“
Proteinkinase C-Familie, auch klassische PKCs bei der Entstehung der granules
eine Rolle spielen. Über PKCs hinausgehend fand ich, dass auch die RII alpha
Untereinheit der Proteinkinase A (PKA) in Folge von Stress in Stress granules
und P-bodies lokalisiert ist. Somit decken meine Daten eine neue Funktion der
PKCε innerhalb der Bildung von RNAgranules auf, die in einer veränderten
Proteintranslation resultieren. Meine Daten eröffnen damit die Möglichkeit zu
untersuchen, in welchem Maß die Rekrutierung von PKCε und PKA zu
zytoplasmatischen RNA granules ähnliche Funktionen innerhalb der
Stressantworten ausführt und in welchem Maß Translationsregulation den
Übergang von akuter Aktivierung zu langanhaltenden Effekten zu erklären
vermag.
en
dc.format.extent
III, 97 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
stress granules
dc.subject
protein translation
dc.subject
oxidative stress
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Role of PKCε in RNA granule formation and protein translation
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. T. Hucho
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. P. Knaus
dc.date.accepted
2013-08-13
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000095047-9
dc.title.translated
Modulation von RNA Granules und Proteintranslation durch die Proteinkinase C
Epsilon
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000095047
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000013982
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access