Alzheimer’s disease (AD), a progressive neurodegenerative disease, is the most common form of dementia in later life and a major cause of disability and death in the elderly.1 Amyloid-β (Aβ) immunotherapy for patients with AD offers an important chance for treating this devastating disease. However the mechanism by which antibodies reduce Aβ deposition in the brain is still unknown. There have been three mechanisms postulated to explain how antibody- directed clearance of Aβ could work – activation of microglial phagocytosis, catalytic dissolution of Aβ fibrils and shift of the Aβ equilibrium from the central nervous system to the blood. The latter was termed the peripheral sink hypothesis, and argues that anti-Aβ antibodies sequester circulating Aβ to either favor increased clearance from the brain or simply to prevent the influx to the brain. The main object of this thesis was to prove or falsify the peripheral sink hypothesis in vivo. To accomplish this, I utilized novel transgenic (tg) mice which produce anti-Aβ IgM antibodies (AB9-IgM) and B cell-bound anti-Aβ IgG antibodies (AB9µ mice), as well as a novel mouse strain only producing B cell-bound anti-Aβ antibodies (DelS mice). Neither B cells nor IgM antibodies are expected to enter the brain during the course of AD,2 thereby restricting anti-Aβ antibodies to the periphery. 15B3 mice served as control as they harbor the same IgM transgene with a CDR (Complementarity Determining Region) of unknown specificity. First, the immunophenotype of AB9µ and DelS mice was assessed through flow cytometric analyses of B cell development, B cell proliferation as well as peripheral blood immune cells and B cells. Further assessment strategies included histological examination and in vivo infection assays utilizing vesicular stomatitis viridae (VSV). All AB9µ and DelS lines contained tg B cells and all AB9µ lines elicited anti-Aβ- antibody titers. Both AB9µ and DelS mice were lacking obvious alterations in the immune system, which has insofar been shown to be crucial, as a growing number of publications report that changes of the systemic immune system influence AD pathology3-5, which could blur putative specific changes of the transgenes introduced by us (AB9µ and DelS) in AD mouse models. Second, we crossed AB9µ and DelS mice to two different AD mouse models – APPPS1 and TgSwDI mice – as they show biochemical and histological differences in the deposited Aβ. Notably, we observed a reduction of Aβ plaque load at 250 days in AB9µ-APPPS1 mice and – to some extent – in DelS-APPPS1 mice with Aβ42 being the prevalent Aβ species reduced. The noted reduction of Aβ burden at 250 days was limited to diffuse plaques and did not involve compact core plaques. At 120 days, we only observed alterations in plaque size distribution in AB9µ- APPPS1, which might be due to the fast kinetics of de novo plaque generation at this rather early time point which overrules putative anti-Aβ antibody- mediated effects. One key finding providing further evidence for the peripheral sink paradigm is the increase in serum Aβ42 in AB9µ-APPPS1 mice which is in accordance with the predominant reduction in Aβ42 in the brain of these mice. In TgSwDI mice crossed to AB9µ and DelS mice we could not find any difference in plaque deposition. Yet, the data obtained in TgSwDI mice are – in contrast to the data obtained in APPPS1 mice – not fully conclusive as TgSwDI mice – due to the Dutch/Iowa mutations within the Aβ peptide – do not serve as an ideal tool for the herein proposed question. Intracerebroventricular (icv) administered AB9-IgM antibodies did not exhibit an alteration in plaque load, whilst icv administered AB9-IgG significantly ameliorated Aβ pathology. This demonstrated that – even if IgM antibodies can cross the blood brain barrier – AB9-IgM antibodies are less likely to produce the same effect as AB9-IgG due to the fact that IgM effector functions might not be sufficient to reduce plaque load locally and/or that AB9-IgM cannot penetrate that far into the tissue. Further studies in another AD mouse model, namely APP23 mice, could further help to dissect the contribution of the peripheral sink to immunotherapeutic approaches. Studies focusing on transport and degradation systems involved in the peripheral clearance of Aβ could promote to unravel the mechanism underlying immunotherapy. A better insight into the action of Aβ immunotherapy might help to design and test new combination therapies.
Die Alzheimer’sche Erkrankung (AE) - eine progressive neurodegenerative Erkrankung - ist die häufigste Demenz des späteren Lebensabschnitts und eine der Hauptursachen für Invalidität und Tod bei alten Menschen. Die Beta-Amyloid (Aβ)-Immuntherapie bietet eine vielversprechende Möglichkeit für die Behandlung dieser verheerenden Erkrankung. Jedoch ist der Wirkungsmechanismus, durch den Aβ-Antikörper Aβ-Ablagerungen im Gehirn reduzieren, immer noch nicht geklärt. Drei mögliche Wirkungsmechanismen wurden bisher beschrieben– Aktivierung von Aβ-phagozytierenden Mikroglia, katalytischer Abbau der Aβ- Fibrillen oder die Verschiebung des Aβ-Gleichgewichts vom zentralen Nervensystem in Richtung des peripheren Blutstroms. Letzteres wurde als „peripheral sink“-Hypothese“ bezeichnet und beinhaltet, dass anti-Aβ Antikörper peripher zirkulierendes Aβ binden. Dadurch begünstigen sie das Ausschleusen von Aβ aus dem Gehirn und/oder verhindern den Wiedereintritt von Aβ ins Gehirn. Das Hauptziel dieser Dissertation war das Bestätigen oder Wiederlegen dieser „peripheral sink“-Hypothese“ in vivo. Um dies zu erreichen, verwendete ich in unserem Institut generierte transgene (tg) Mauslinien, die freie tg IgM-Antikörper (AB9-IgM) und B-Zell-gebundene IgM-Antikörper (AB9μ Mäuse) gegen das Plaque-bildende Aβ produzieren. Als weiteres in unserem Institut generiertes Modell dienten die DelS Mäuse, die ausschließlich B-Zell- gebundene Aβ-IgM-Antikörper enthalten. Es wird angenommen, dass weder B-Zellen noch IgM-Antikörper die Blut-Hirn-Schranke im Verlauf der Alzheimer-Erkrankung überwinden. Dadurch existieren die tg Aβ-IgM-Antikörper in beiden Mausmodellen (AB9μ und DelS) nur in der Peripherie. 15B3-Mäuse dienten als Negativkontrolle, da sie das gleiche IgM-Transgen jedoch mit einer CDR (Komplementarität-bestimmende Region) unbekannter Spezifität exprimieren. Zunächst wurde der Immunphänotyp der AB9μ und DelS Mäuse mit Hilfe von durchfluss-zytometrische Analysen untersucht. Dafür wurden zum einen die B -Zell-Entwicklung, B-Zell-Proliferation und das B-Zellprofil sowie die zelluläre Zusammensetzung des peripheren Blutes analysiert. Zum anderen wurden AB9μ und DelS Mäuse einer histopathologischen Untersuchung und Infektionsstudien mit Erregern der vesikulären Stomatitis (VS) unterzogen. Alle AB9μ und DelS Linien exprimierten tg B-Zellen und die AB9μ Linien entwickelten zusätzlich Aβ-Antikörpertiter. Sowohl AB9μ als auch DelS Mäuse zeigten keine offensichtlichen Veränderungen im Immunsystem. Diese Beobachtung ist deswegen von Bedeutung, weil einige Publikationen von Veränderungen im systemischen Immunsystem berichten, die die Alzheimer-Pathologie beeinflussen und demnach auch vermeintlich spezifische Auswirkungen der tg Aβ-IgM- Antikörper verdecken könnten. Als nächstes kreuzte ich die AB9μ und DelS Mäuse mit zwei verschiedenen Alzheimer- Mausmodellen - APPPS1 und TgSwDI Mäuse - da diese biochemische und histologische Unterschiede in dem abgelagerten Aβ aufweisen. Bemerkenswerterweise beobachtete ich eine Reduktion der Aβ-Last und der zerebralen Plaques in 250-Tage-alten AB9μ-APPPS1 Mäusen und - in gewissem Umfang – auch in DelS-APPPS1 Mäuse, wobei vor allem Aβ42 reduziert war. Allerdings waren nur diffuse Plaques und nicht kompakte Plaques mit Amyloidkern von dieser Reduktion betroffen. Zu einem früheren Analysezeitpunkt - nach 120 Tagen – konnten wir nur eine Veränderung in der Plaque- Größenverteilung in AB9μ-APPPS1 beobachten und keine Reduktion in der Plaquelast. Dies könnte auf die schnelle Kinetik der Plaque-Neubildung zu diesem frühen Zeitpunkt zurückzuführen sein, welche vermeintliche Aβ-IgM- Antikörper-vermittelte Effekte ausgleichen könnte. Ein Schlüsselergebnis, welches einen weiteren Beleg für das „peripheral sink“-Paradigma liefert, ist die Zunahme von Serum- Aβ42 in AB9μ-APPPS1 Mäusen, was in Übereinstimmung mit der vorherrschenden Verringerung von Aβ42 im Gehirn dieser Mäuse ist. In TgSwDI Mäusen, die mit AB9μ und DelS Mäusen gekreuzt wurden, konnte ich keinen Unterschied in der Aβ-Plaquelast beobachten. Allerdings sind die Daten aus den TgSwDI Mäusen - im Gegensatz zu den Daten aus den APPPS1 Mäusen - nicht absolut schlüssig, da die TgSwDI Mäuse - aufgrund der Dutch/ Iowa-Mutationen innerhalb des Aβ-Peptids - nicht als ideales Modell für die hier gestellte Frage dienen. Eine weitere Untersuchung mit intrazerebroventrikulär (izv) verabreichten AB9-IgM-Antikörper zeigte keinen zentralnervösen Einfluss auf die Aβ-Plaquelast, während izv verabreichte AB9-IgG-Antikörper die Aβ- Pathologie signifikant verbesserten. Das deutet daraufhin, dass - auch wenn IgM-Antikörper die Blut-Hirn-Schranke überwinden können - AB9-IgM-Antikörper höchstwahrscheinlich nicht in der Lage sind die gleiche zentralnervöse Wirkung wie AB9-IgG zu erzielen, möglicherweise weil die durch IgM-Antikörper- vermittelten Effektorfunktionen nicht ausreichen, um die Aβ-Pathologie lokal im Gehirn zu reduzieren und/ oder AB9-IgM-Antikörper nicht so weit in das Gewebe diffundieren können. Weitere Studien in anderen Alzheimer-Mausmodellen, zum Beispiel den APP23 Mäusen, könnten weiter behilflich sein, den Beitrag der „peripheral sink“ zu immuntherapeutische Ansätze zu analysieren. Untersuchungen mit dem Schwerpunkt auf möglichen Transport- und Abbau- Mechanismen, die bei dem peripheren Abbau von Aß eine Rolle spielen, könnten dabei helfen den peripheren Mechanismus, welcher der Immuntherapie zugrunde liegt, aufzudecken. Letztendlich könnte ein tieferer Einblick in die Wirkungsweise der Aβ-Immuntherapie dabei helfen neue Kombinationstherapien zu entwerfen und zu testen.
