Innovative options for the treatment of non-melanoma skin cancer: Investigations on the activity of antimicrobial peptides against topical diseases and study of peptide penetration into human skin ex vivo

Abstract

This work focused on the investigation of antimicrobial peptides (AMPs) as potential innovative option for the treatment of non-melanoma skin cancer (NMSC). The effect of several AMPs, including melittin, cecropin A, protegrin-1 and histatin 5, on viability and proliferation on SCC12 and SCC25 cell lines was compared to effects on normal human keratinocytes (NHKs). Especially melittin has strong and fast cytotoxic activity on SCC12 and SCC25 cancer cell lines. However, melittin does not exhibit selectivity and was toxic against NHKs. Interestingly, melittin efficacy was enhanced by the combination with 5-fluorouracil (5-FU) while NHK-toxicity was reduced. Similar results were obtained with cecropin A combined with 5-FU. Focusing on topical application, penetration of melittin into human skin ex vivo was compared with two nontoxic cell-penetrating peptides (CPPs), low molecular weight protamine (LMWP) and penetratin. Penetration of the fluorescence-labeled peptides into viable layers of the skin was observed after 24 hours exposure. Peptide and peptide fragments, which are covalently bond to the fluorescent dye, were detected by high pressure liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. In order to determine influences of enzymatic cleavage during skin penetration, LMWP and penetratin were extracted and the amount of intact peptide was quantified by HPLC. Both CPPs were cleaved to a high extent by skin enzymes after 6 hours exposure, already. The inhibition of enzymes, which are responsible for LMWP cleavage, resulted in an enhanced recovery (compared to no-inhibition) of intact LMWP to 91.7 % (25.3 %) in trypsin, 91.9 % (39.4 %) in skin homogenate and up to 31.9 % (2.3 %) in skin tissue after 24 hours exposure, respectively. However, fluorescence microscopy showed that the intact peptides remained to a high extent in the stratum corneum and only a small amount was detected in the viable skin. In order to improve peptide penetration into the skin, loading onto dendritic core-multishell (CMS) nanotransporter systems was investigated. Although failed to be loaded onto the nanotransporter, the penetration of LMWP into the skin was enhanced in the presence of nanoparticles. This observation indicates an influence of CMS nanotransporter on the skin barrier. Another target for the treatment of NMSC is the inhibition of the polymerase alpha. Previous investigations have shown cytotoxic and antiproliferative effects of the guanosine phosphonate, OxBu, against various cancer cell lines. OxBu release from different dosage forms, including OxBu encapsulated in solid lipid nanoparticles (SLN), hydrophilic OxBu gel, OxBu-SLN embedded into a hydrophilic gel matrix and aqueous OxBu solution, was part of this work. Embedment of OxBu-SLN into hydrophilic gel allows strongest sustained release compared to the other dosage forms. Topical application is still a challenge for natural occurring as well as synthetic drugs. Detailed insights into release, penetration, metabolism and biological activity of innovative agents within this work are the basis for future use in dermatotherapy.

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Erforschung antimikrobieller Peptide (AMPs) als potentielle neue Behandlungsoptionen für das Indikationsgebiet des hellen Hautkrebses. Dafür wurde die Wirkung von AMPs (Melittin, Cecropin A, Protegrin-1 und Histatin 5) auf die Viabilität und Proliferation von SCC12 und SCC25 Krebszelllinien im Vergleich zu normalen humanen Keratinozyten geprüft. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass insbesondere Melittin sehr schnell und stark zytotoxisch auf SCC12 und SCC25 Zelllinien wirkt. Jedoch erwies sich Melittin als unselektiv, es wirkte ebenso toxisch auf normale Keratinozyten. Interessanterweise erhöht die Kombination von Melittin mit dem Goldstandard in der Behandlung des hellen Hautkrebses, 5-Fluorouracil (5-FU), die Selektivität der Wirkung. Ähnlich verhielt sich Cecropin A. Zur Untersuchung einer möglichen topischen Applikation wurde die Penetration von Melittin in Humanhaut ex vivo vergleichend zu zwei nicht toxischen zellpenetrierenden Peptiden (CPPs), Penetratin und niedermolekulares Protamin (LMWP), getestet. Eine Penetration der fluoreszenzmarkierten Peptide in tiefe Hautschichten war nach 24 h Exposition erkennbar. Peptide und Peptidfragmente, die kovalent am Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind wurden mit Hilfe einer HPLC-Methode mit Fluoreszenzdetektion erfasst. Um enzymatische Einflüsse während der Hautpenetration zu ermitteln, wurden LMWP und Penetratin aus der Haut extrahiert und die Menge des intakten Peptides mit HPLC und Fluoreszenzdetektion quantifiziert. Beide CPPs unterlagen innerhalb von 6 Stunden einer ausgeprägten Biotransformation. Die Inhibition der am Abbau beteiligten Enzyme resultierte in einer erhöhten Wiederfindung (im Vergleich zu nicht inhibierten Enzymen) des intakten LMWPs von 91,7 % (25,3 %) in Trypsin, 91,9 % (39,4 %) im Hauthomogenisat und bis zu 31,9 % (2,3 %) in Humanhaut nach 24 stündiger Inkubation. Allerdings verweilte das intakte Peptid vorwiegend im Stratum corneum und wurde nur in geringen Mengen in der lebenden Epidermis und Dermis detektiert. Um die Aufnahme von Peptiden in der Haut zu erhöhen, erfolgten Untersuchungen zum Einschluss von LMWP und Penetratin in Dendrimernanopartikel. Obwohl beide Peptide nicht eingeschlossen werden konnten, erhöhte allein die Anwesenheit der Nanopartikel die Hautpenetration von LMWP. Dendrimernanopartikel scheinen daher einen Einfluss auf die Hautbarriere zu haben. Ein weiterer Angriffspunkt für die Behandlung des hellen Hautkrebses stellt die Inhibition des Enzyms Polymerase alpha dar. Frühere Studien zeigten zytotoxische und antiproliferative Wirkungen des Guanosinphosphonates OxBu auf verschiedene Krebszelllinien. Die Freisetzung von OxBu aus vier Formulierungen, OxBu in feste Lipidnanopartikel (SLN), OxBu in einer hydrophilen Gelmatrix, OxBu-SLN eingebettet in einer hydrophilen Gelmatrix sowie eine wässrige OxBu-Lösung, war Gegenstand dieser Arbeit. Insbesondere die Einbettung von OxBu-SLNs in einer hydrophilen Gelmatrix erlaubt eine stärkere Retardierung im Vergleich zu den anderen Formulierungen. Die topische Applikation stellt nach wie vor eine große Herausforderung sowohl für natürlich vorkommende als auch für synthetische Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Freisetzung, Hautpenetration und Metabolisierung und biologischen Wirkung neuartiger Wirkstoffe, legen den Grundstein für einen zukünftigen Einsatz in der Dermatotherapie.