Die Rolle des Aminosäure- und Peptidmetabolismus für das intrazelluläre Wachstum von Salmonella enterica Subsp. enterica Serovar Typhimurium

Abstract

Der Zoonose-Erreger Salmonella enterica Subsp. enterica Serovar Typhimurium ist neben dem Serovar Enteriditis verantwortlich für den Hauptanteil von non- typhoiden Salmonellosen weltweit mit jährlich mehreren Millionen Fällen und tausenden Toten (Hohmann, 2001; Alvarez-Ordonez et al., 2011). Intensiver Einsatz von Antibiotika sowohl in der Human- als auch Veterinärmedizin sowie in der Tierhaltung führten in den vergangen Dekaden zu einem rasanten Anstieg multiresistenter Salmonella Stämme wie z.B. Stamm DT104 (Cloeckaert & Schwarz, 2001) Generierung alternativer Bekämpfungsstrategien sowie die Etablierung sicherer Vakzinierungsstämme sind daher sowohl von großem humanitären als auch ökonomischem und ökologischem Interesse. Die intrazelluläre Replikation des Pathogens ist an die vorhandenen Nährstoffe bzw. adaptierte Biosyntheseleistung geknüpft. Eine gezielte Unterbrechung der Nährstoffquelle(n) bzw. von essentiellen Biosynthesewegen würde eine effektvolle Alternative zur herkömmlichen Antibiotikatherapie erschließen und neue Erkenntnisse für die Generierung von Vakzinierungsstämmen liefern. Die Beobachtung, dass der zur Vakzinierung eingesetzte Stamm SL1344 ΔaroA durch die Zugabe von para-Aminobenzoesäure zur Diät der gewählten Versuchstiere eine erneute Hochvirulenz hervorrief (Stocker et al., 1983), führte zu der Annahme, dass intrazellulär persistierende Salmonella Thyphimurium Zugang zu extrazellulären Nährstoffen haben müssen. Dies warf drei grundsätzliche Fragen auf, die in dieser Studie untersucht werden sollten: Ist die de novo- Biosynthese von Aminosäuren essentiell für die intrazelluläre Replikation? Welche Rolle spielen Aminosäuren bzw. Peptide für das intrazelluläre Wachstum? Besteht die Möglichkeit, intrazelluläre Salmonella Typhimurium durch die Zugabe artifizieller Peptide zu beeinträchtigen? Um die Rolle der de novo- Aminosäure-Biosyntheseleistung bzw. von Peptiden und ihre intrazelluläre Verfügbarkeit untersuchen zu können, wurden rund 130 Mutanten mit rund 200 Mutationen (Einzeln/Kombination) erzeugt, bei denen diverse Aminosäure- Biosynthesewege bzw. -Transportsysteme unterbrochen bzw. deletiert vorlagen. Der Mutationseinfluss wurde durch in vitro-Infektionsversuche, im Vergleich zum Wildtypstamm, an humanen intestinalen Epithelzellen (LoVo) mittels Invasions- und Replikations-Assays analysiert. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in umfassender Weise gezeigt werden, dass, entgegen der herrschenden Lehrmeinung (Haraga et al., 2008), die de novo- Biosyntheseleistung von Aminosäuren keinen Einfluss auf die intrazelluläre Replikation innerhalb der verwendeten Zelllinie hat. Des Weiteren konnten Beweise dafür gesammelt werden, dass intrazelluläre S. Typhimurium Zugang zu freien Aminosäuren haben bzw. dass Peptide das Nährstoffspektrum erweitern könnten. Es konnte ebenfalls erstmals gezeigt werden, dass es generell möglich ist, die intrazelluläre Replikation von Salmonella Thyphimurium über die Zugabe von artifiziellen Peptiden zu beeinträchtigen. Weiterführend wurde der biosynthetische Zusammenhang des ΔaroA-Phänotyps unter Einsatz des weit verbreiteten und flächendeckend genutzten Tierfutterergänzungsmittels „para- Aminobenzoesäure (PABA)“ analysiert. Die erzeugten Daten können zukünftige genutzt werden um alternative Behandlungsmethoden gegen Salmonella-Infektionen zu etablieren.

The zoonotic pathogen Salmonella enterica Subsp. enterica Serovar Typhimurium, is together with serovar Enteriditis, responsible for the majority of non- typhoid salmonellosis annually worldwide with millions of cases and thousands of deaths (Hohmann, 2001; Alvarez-Ordonez et al., 2011). Excessive use of antibiotics in both human and veterinary medicine and in animal husbandry in recent decades led to a rapid rise of multidrug-resistant S. Typhimurium strains like strain S. Typhimurium DT104 (Cloeckaert & Schwarz, 2001). The generation of alternative control strategies and the establishment of safe vaccination strains are therefore of great humanitarian, economic and ecological interests. Intracellular replication of the pathogen is linked to the available nutrients or adaptation of the pathogen to intracellular metabolism. Targeted disruption of the nutrient source or of essential biosynthetic pathways could open up alternatives to conventional antibiotic therapy and provide new insights for the generation of vaccination strains. The observation that the SL1344 ΔaroA-vaccine regained virulence in vivo by the addition of para-aminobenzoic acid to the diet of the selected experimental animals (Stocker et al., 1983) led to the assumption that intracellular persistent Salmonella must have access to intra- or extracellular nutrients. This raised three fundamental questions that were adressed in this study: Is the de novo biosynthesis of amino acids essential for intracellular replication? What is the role of amino acids or peptides for intracellular growth? Can intracellular Salmonella be affected or accessed by the addition of artificial peptides? To investigate the role of de novo amino acid biosynthesis, of peptides and their intracellular availability approximately 130 mutants were generated in which various amino acid biosynthetic pathways and transport systems were deleted. The influence of these approximately 200 mutations (single / combined) was analyzed by in vitro infection experiments on human intestinal epithelial cells (LoVo) with invasion / replication assays. The effect of the deletion(s) on the intracellular replication was compared with that of the wild type strain. I have shown in a systematic study that, contrary to the prevailing view (Haraga et al., 2008), the de novo biosynthesis of amino acids has little or no effect on the intracellular replication of Salmonella Typhimurium in human intestinal epithelial cells. I acquired new evidence that intracellular S. Typhimurium have access to both free amino acids and peptides, which extend the nutrient spectrum within host cells. It could also be shown for the first time that it is possible to target intracellular Salmonella through the addition of external, artificial peptides. Furthermore, the role of the aroA mutation, a widely used basis for generation of vaccine strains, was analyzed in detail with regard to its connection with the biosynthesis of para-amino benzoic acid (PABA), a compound found in animal feed supplements. The data generated in this study provide a significant contribution supporting future studies toward understanding the intracellular growth of Salmonella as well as generation of alternative treatments of Salmonella infections.