Untersuchung der Funktion von hSNM1B/Apollo im Fanconi-Anämie/BRCA- Reparaturweg

Abstract

Einleitung: Die Fanconi-Anämie (FA) ist ein seltenes Chromosomeninstabilitätssyndrom, das sich durch kongenitale Fehlbildungen, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von malignen Erkrankungen und Knochenmarkversagen manifestiert. Ursächlich ist eine Störung der zellulären Reparatur von DNA-Interstrangvernetzungen (ICLs), deren Entstehung vermutlich hauptsächlich durch reaktive Aldehyde wie Acetaldehyd bedingt wird. Aktuell sind 19 Gene bekannt, die für FA-Proteine kodieren (FANCA-FANCT); diese bilden gemeinsam mit anderen Proteinen den FA/BRCA-DNA-Reparaturweg. Die Nuklease hSNM1B/Apollo ist neben ihrer Funktion beim Schutz der Telomere ebenfalls an der ICL-Reparatur beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ihre Rolle im FA /BRCA-Reparaturweg charakterisiert. Methodik: Ko-Immunopräzipitationsstudien mit endogenen, ektopisch exprimierten und in-vitro translatierten Proteinen wurden durchgeführt, um die Interaktion von hSNM1B/Apollo und dem FA-Protein FANCP/SLX4 zu untersuchen und ihre Bindungsdomänen zu kartieren. Dieselbe Methode wurde zur Charakterisierung der hSNM1B/Apollo-Multimerbildung verwendet. Zur Analyse der Telomerfunktionen von FANCP/SLX4, FANCD2 und FANCA wurden nach ihrer Depletion in U2OS-Zellen die zellulären Mengen der Telomer- assoziierten Proteine TRF1 und TRF2 im Western Blot quantifiziert. Außerdem wurden Telomerdysfunktion-induzierte Foci (TIFs) in hSNM1B/Apollo-depletierten Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Kolonienbildungsstudien und Chromosomenbrüchigkeitsuntersuchungen lieferten Erkenntnisse über den Effekt einer Acetaldehyd-Behandlung auf hSNM1B/Apollo- oder/und FANCP/SLX4 -depletierte-Zellen. Ergebnisse: Eine Bindung von hSNM1B/Apollo an endogenes FANCP/SLX4 konnte gezeigt werden, im zellfreien System bestand diese Interaktion jedoch nicht. Die Ergebnisse der Versuche zur Kartierung der Proteinbindungsstellen deuteten auf mindestens zwei separate Interaktionsdomänen hin. Auch die Bindung von hSNM1B/Apollo an weitere hSNM1B /Apollo-Moleküle bestand nur zwischen zellulär synthetisierten Proteinen und wird über mehrere Domänen vermittelt. Die Depletion von FANCP/SLX4 führte zu einer signifikanten Reduktion der zellulären TRF2-Menge und eine hSNM1B /Apollo-Depletion ging mit einem signifikanten Anstieg an dizentrischen Chromosomen und TIFs einher. Nur FANCP/SLX4-depletierte Zellen wiesen eine gesteigerte, aber milde Sensitivität gegenüber Acetaldehyd auf. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse dieser Untersuchungen liefern weitere Beweise für die duale Funktion von hSNM1B/Apollo bei der DNA-Schadensantwort und der Aufrechterhaltung der Telomerintegrität. Über eine komplexe und womöglich über post-translationale Modifikationen vermittelte Interaktion bindet die Nuklease an FANCP/SLX4 und ist darüber direkt mit dem FA/BRCA- Reparaturweg verbunden. Zudem induziert ihre Depletion eine Telomerdysfunktion mit Hinweisen für Telomerfusionen. Da hSNM1B/Apollo-depletierte Zellen bekanntermaßen Hypersensitivitäten gegenüber ICL-induzierenden Substanzen aufweisen, gibt die fehlende Acetaldehyd-Hypersensitivität Anlass zur kritischen Hinterfragung des aktuellen Wissensstands über den primären Schädigungsmechanismus des Aldehyds. Die milde Acetaldehyd-Hypersensitivität von FANCP/SLX4-depletierten Zellen bekräftigt Schlussfolgerungen anderer Studien, nach denen Mutationen in verschiedenen FA-Genen unterschiedlich ausgeprägte zelluläre Empfindlichkeiten gegenüber demselben DNA-schädigenden Agens bedingen können.

Objectives: Fanconi Anemia (FA) is a genetic disorder manifesting in congenital defects, increased risk of cancer and bone marrow failure. The primary defect lies in the inability of affected cells to repair DNA interstrand crosslinks (ICLs), many of which are likely caused by reactive aldehydes such as acetaldehyde. To date, there are 19 known genes that encode FA proteins (FANCA-FANCT), all of which function in the FA/BRCA DNA repair pathway. In addition to protecting telomeres, the nuclease hSNM1B/Apollo is also involved in the repair of ICLs. The experiments performed here examine the role of hSNM1B/Apollo within the FA/BRCA pathway. Methods: Co- immunoprecipitation experiments were performed with endogenous, ectopically expressed and in-vitro translated proteins to analyze the interaction between hSNM1B/Apollo and the FA protein FANCP/SLX4 and to map their binding domains. The same method was used to study the binding of hSNM1B/Apollo to other hSNM1B/Apollo molecules. The functions of FANCP/SLX4, FANCD2 and FANCA at telomeres in U2OS cells were examined after their depletion by quantifying the cellular amounts of the telomeric proteins TRF1 and TRF2 on Western Blots. Telomere dysfunction-induced foci (TIFs) were analyzed via immunofluorescence microscopy after hSNM1B/Apollo depletion. Colony survival and chromosome breakage assays were performed to examine the effects of acetaldehyde-exposure on hSNM1B/Apollo- or/and FANCP/SLX4-depleted cells. Results: While hSNM1B/Apollo was shown to bind endogenous FANCP/SLX4, this interaction could not be confirmed with in-vitro translated proteins. Mapping of the interacting domains suggested at least two separate binding areas. Similarly, only endogenously produced hSNM1B/Apollo was able to bind other hSNM1B/Apollo molecules and multiple binding sites mediate this interaction. The depletion of FANCP/SLX4 lead to a significant reduction of TRF2 and depleting cells of hSNM1B/Apollo significantly increased the amounts of dicentric chromosomes and TIFs. A mild hypersensitivity for acetaldehyde was observed only in FANCP/SLX4-depleted cells. Conclusion: These results further establish the dual role of hSNM1B/Apollo compromised of DNA-damage repair and telomere maintenance. Via a complex interaction with FANCP/SLX4, which is possibly being mediated by post-translational modifications, the nuclease is directly linked to the FA/BRCA-pathway. Its’ depletion induces telomere dysfunction with signs of telomere fusions. Since hSNM1B/Apollo-depleted cells show hypersensitivities towards ICL-inducing agents, their lack of hypersensitivity towards acetaldehyde raises questions regarding the primary DNA-damaging mechanism of this particular aldehyde. The mild hypersensitivity observed in FANCP/SLX4-depleted cells supports conclusions of other studies suggesting that mutations in different FA genes can lead to distinctive cellular sensitivities for specific DNA-damaging agents.