In the first project, I searched for a GPI-anchored protein that is involved in mechanotransduction. Vallet and colleagues identified a GPI-anchored serine protease CAP-1 that activates the ion channel ENaC (Vallet et al., 1997). Since ENaC is related to the mechanotransduction channel BNC1, we hypothesized that a related protease may influence BNC1 activity and therefore regulate mechanoreceptor sensitivity. Preliminary studies by Gary Lewin showed that cleavage of GPI-anchored proteins reduces sensitivity of low threshold mechanoreceptors. My goal was to purify this protein using protein chemistry methods. In protease assays I showed that sensory neurons indeed express a protease that is released after treatment with PIPLC, an enzyme that cleaves GPI-anchors. I also showed in binding experiments that PIPLC treatment also releases factors that bind to the mechanotransduction channel BNC1. Several chromatographic methods were used, but it was not possible to purify the protein. For a successful purification in future, a larger amount of starting material and a more reliable assay for the protein would be necessary. In the main project I took an alternative approach to find mechanotransduction genes. Carroll and colleagues found that BDNF +/- mice display a reduced sensitivity in SA low threshold mechanoreceptors (Carroll et al., 1998). Another study by Stucky and colleagues showed that NT-4 -/- mice lose the D-hair receptors (Stucky et al. 1998). Using Affymetrix oligonucleotide arrays in combination with a subtracted cDNA library I looked for genes that are downregulated in the DRG of these mutant mice in order to identify the genes responsible for these phenotypes. The BDNF experiment resulted in 142 genes that were downregulated in the Affymetrix study and 284 genes in the subtracted library. In BDNF +/- mice, only SA mechanoreceptors comprising a subgroup of large diameter neurons are affected, therefore genes of interest should display a specific expression pattern in large diameter neurons of DRG. DIG-labelled RNA probes derived from a few of the candidate genes were used for in-situ hybridisation, but none of them matched this criterion. Expression patterns of more candidate genes remain to be examined. In the NT-4 experiment, we wished to find genes expressed only by D-hair mechanoreceptors. Combined analysis of the oligonucleotide microarray study and the subtracted cDNA libraries resulted in 28 candidate genes. In-situ hybridisation revealed that one gene, the T-type calcium channel CaV3.2, was specifically expressed in medium sized neurons and disappeared almost completely in NT-4 -/- mice. I therefore concluded that CaV3.2 is specifically expressed in D-hair mechanoreceptors. In addition, using an in vitro skin nerve preparation we showed that antagonists acting selectively on T-type calcium channels can block D-hair receptor mechanosensitivity and reduce receptor excitability. I suggest that calcium channels may function to amplify mechanoreceptor responses and thereby specify receptor properties.
In meinem ersten Projekt suchte ich nach einem GPI-verankerten Protein, das an der Mechanotransduktion beteiligt ist. Vallet et al. identifizierten eine GPI- verankerte Serinprotease (CAP-1), die den Ionenkanal ENaC (Vallet et al., 1997) aktiviert. ENaC ist verwandt mit dem Mechanotransduktionskanal BNC1. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine ähnliche Protease die Aktivität von BNC und somit die Mechanotransduktion moduliert. Gary Lewin zeigte in vorläufigen Experimenten, dass die Behandlung der Haut der Maus mit dem GPI-spaltendem Enzym PIPLC zu einer verringerten mechanischen Sensitivität führt. Mein Ziel war es, dieses Protein zu reinigen. Mit Hilfe von Protease- Assays zeigte ich, dass eine GPI-verankerte Protease von sensorischen Nerven exprimiert wird. Weiterhin konnte ich mit Hilfe von Bindungsexperimenten zeigen, dass durch PIPLC-Behandlung des Ischias-Nervs ein Protein freigesetzt wird, das an BNC1 bindet. Unterschiedliche chromatographische Methoden wurden benutzt, um das Protein zu isolieren, jedoch ohne Erfolg. Für eine erfolgreiche Reinigung in der Zukunft wird eine größere Menge an Startmaterial und ein empfindlicheres Assay vonnöten sein. In meinem Hauptprojekt wählte ich eine andere Methode, um Mechanotranduktionsgene zu finden. Carroll et al zeigten, dass BDNF +/- Mäuse einen Defekt in langsam adaptierender Mechanotransduktion aufweisen (Carroll et al., 1998). Stucky et al. zeigten, dass NT-4 -/- Mäuse die sog. D-Haar Mechanorezeptoren verlieren (Stucky et al., 1998). Mit Hilfe von Affymetrix Oligonukleotidarrays und einer Subtraktionsbibliothek suchte ich nach Genen, die in den mutanten Mäusen herunterreguliert sind, um die Gene zu identifizieren, die verantwortlich für diesen Phenotyp sind. Im BDNF-Projekt waren 142 Gene herunterreguliert im Affymetrix-Experiment und 284 Gene in der subtrahierten Bibliothek. Interessante Gene wurden mit Hilfe der in-situ Hybridisierung auf ihre zellspezifische Expression untersucht. Ich suchte nach Genen, die in großen Neuronen exprimiert und herunterreguliert sind in BDNF +/- Spinalganglien. Bislang entprach jedoch keines der untersuchten Gene diesem Kriterium. Im NT-4 Projekt suchte ich nach Genen, die spezifisch in D-Haar-Mechaorezeptoren exprimiert sind. Eine kombinierte Analyse des Genchip- und Subtraktionsexperiments ergab 28 Gene, die signifikant in NT-4 -/- Spinalganglien herunterreguliert sind. Einer dieser 28 Gene, der T-typ Calciumkanal CaV3.2 war spezifisch in mittelgroßen Neuronen exprimiert und nahezu verschwunden in NT-4 -/- Spinalganglien und war daher ein sehr guter Kandidat für ein D-Haar Mechanorezeptor-spezifisches Gen. In der Folge konnte mit Hilfe der in vitro Haut-Nerv Preparation gezeigt werden, dass ein T-typ Calciumkanal spezifischer Antagonist die Sensitivität von D-Haar Mechanorezeptoren spezifisch beeinträchtigen kann. Ich stelle daher die Hypothese auf, dass die Expression von T-typ Calciumkanälen eine Verstärkung der Rezeptorsensibilität zur Folge hat.
