In this study the role of histone modifications and their potential interactions with four key cardiac transcription factors in the context of heart development and congenital heart diseases were studied. While histone modifications influence the compaction of chromatin and consequently the accessibility of DNA, transcription factors (TFs) are responsible for a fine tuning of expression. Two histone acetylations and two histone methylations were studied which were previously described to be associated with active transcription: H3ac, H4ac, H3K4me2 and H3K4me3. The transcription factors Gata4, Mef2a, Nkx2.5, and Srf are known to be essential for heart development and form a regulatory subnetwork in which they regulate each others expression. To gain insight into the processes regulating gene expression, the histone modifications and transcription factors were investigated, using heart and skeletal muscle cells as model systems. Their combinatorial occurrence was determined by chromatin immunoprecipitation followed by detection on custom arrays (ChIP-chip). The arrays represent the 12,625 transcription start sites of 8,585 murine genes. This information was combined with expression array data of the same genes and RNA interference (RNAi) experiments targeting the investigated transcription factors. The developed research tools such as array designs, the software package for the analysis, the raw data and a results database were made publicly available. The presented data set demonstrated that the average transcript levels associated with combinations of modifications are not simply related to those associated with individual modifications, supporting the histone code hypothesis: Different combinations of modifications are associated with significantly different transcript levels and the levels of these combinations are not additively related to the levels associated with the individual modifications. The dynamics of histone modifications during muscle cell differentiation suggests that they may have a major function as signaling marks for the recruitment of TFs. The four investigated transcription factors not only regulate each others expression but also have a high number of coregulated target genes, many of which are themselves transcription factors. An example is the T-box transcription factor Tbx20, which was identified as a novel target. This suggests that Gata4, Mef2a, Nkx2.5, and Srf can be placed at the top of several regulatory cascades. Analysis of the binding sequences showed that the conservation of binding sites is lower than previously suggested and furthermore revealed a novel binding motif for Srf. The TFs were found to frequently bind at sites of histone modifications and to mainly function as activators of transcription. The activating potential of Gata4 and Srf was even enhanced at sites of H3ac: possibly a consequence of the interaction between these transcription factors and the histone acetyl transferase (HAT) p300.
In dieser Arbeit wurden die Rolle von Histon-Modifikationen sowie ihre möglichen Interaktionen mit vier Schlüssel-Transkriptionsfaktoren (TFs) im Kontext von Herz-Entwicklung und angeborenen Herz-Erkrankungen untersucht. Histon-Modifikationen beeinflussen maßgeblich den Grad der Kompaktierung von Chromatin und damit auch die Zugänglichkeit der DNA. Transkriptionsfaktoren dagegen sind für die Feinjustierung der Expression verantwortlich. Zwei Histonacetylierungen und zwei Histonmethylierungen wurden untersucht, deren Einfluss auf die Transkription als aktivierend gilt: H3ac, H4ac, H3K4me2 und H3K4me3. Die Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5, und Srf sind essentiell für die Entwicklung des Herzens und bilden ein Teilnetzwerk, in dem sie ihre Expression gegenseitig regulieren. Um Einblicke in die Steuerung der Genexpression zu erlangen, wurden die Histon-Modifikationen und die vier Transkriptionsfaktoren in Herz- und Skelettmuskelzellen als Modellsysteme verwendet. Die Kombinatorik ihres Auftretens wurde mittels Chromatin-Immunopräzipitation und einer anschließenden Analyse auf maßgeschneiderten Arrays ermittelt (ChIP-chip). Die Arrays repräsentieren die 12.625 Transkription-Starts von 8.585 murinen Genen. Diese Information wurde mit den Ergebnissen einer Expressionsanalyse der gleichen Gene sowie mit RNA Interferenz (RNAi) Experimenten gegen die Transkriptionsfaktoren kombiniert. Die entwickelten Analyse-Werkzeuge, wie die Designs der Arrays, das Software- Paket für die Auswertung, die Rohdaten und eine Datendank der Ergebnisse, wurden über das Internet allgemein zugänglich gemacht. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass die durchschnittlichen Expressionswerte, die mit Kombinationen von Modifikationen einhergehen, sich nicht einfach aus den Expressionswerten der Gene, die mit einzelnen Modifikationen assoziiert sind, ableiten lassen. Diese Befunde unterstützen die Histon Code Hypothese: Verschiedene Kombinationen von Histon-Modifikationen sind mit signifikant unterschiedlichen Expressionswerten verknüpft, und das Expressionsniveau der Kombinationen ergibt sich mitnichten als Summe der Expressionsniveaus, die mit den einzelnen Modifikationen assoziiert sind. Die Dynamik der Histon- Modifikationen während der Differenzierung von Muskelzellen suggeriert, dass sie eine wichtige Rolle als Signale für die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren spielen könnten. Die vier untersuchten Transkriptionsfaktoren regulieren sich nicht nur gegenseitig, sondern haben auch eine hohe Zahl von gemeinsamen Zielgenen, von denen zahlreiche selbst wieder Transkriptionsfaktoren sind. Ein Bespiel dafür ist der als neues Zielgen identifizierte T-box Transkriptionsfaktor Tbx20. Auf Grund dieser Ergebnisse können Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf am Beginn von mehreren regulatorischen Kaskaden plaziert werden. Die Analyse der von den Faktoren gebundenen DNA-Sequenzen zeigt, dass diese weniger gut konserviert sind als bisher vermutet wurde; weiterhin konnte ein neues Bindungsmotif für Srf identifiziert werden. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren binden meist in Bereichen, in denen auch Histon-Modifikationen gefunden wurden, und fungieren überwiegend als Aktivatoren der Genexpression. Dieses aktivierende Potential wird im Falle von Gata4 und Srf noch verstärkt, wenn gleichzeitig H3ac vorliegt; dies ist möglicherweise eine Konsequenz der Interaktion der Transkriptionsfaktoren mit der Histonacetyltransferase (HAT) p300.
