Parameters of two in vitro systems for protein synthesis were analyzed and improved. The optimized systems were used to study some selected antibiotic and to unravel their inhibition mechanisms. The following results have been achieved: 1\. Optimization of a coupled trascription-translation system (Rapid Translation System, Roche). By using the reporter Green Fluorescent Protein (GFP) we demonstrated that proteins are synthesized in high yield (up to 4 mg per ml) but with an unsatisfyingly low-active fraction (about 50%). One reason could be the T7 RNA polymerase routinely used in standard expression systems. The T7 polymerase is up to eight times faster then the intrinsic E. coli transcriptase thus breaking the coupling between transcription and translation in a bacterial system. Accordingly we could demonstrate that the active fraction of the synthesized protein was substantially improved by using either a slower T7 transcriptase mutant or lowering the incubation temperature to 20°C. A drop of protein synthesis observed after 7 h incubation time was not due to a shortage of nucleotide triphosphates, but rather to a shortage of amino acids. Accordingly, a second addition of amino acids after 7 h during an incubation at 20 degrees C led to synthesis of up to 4 mg/ml of GFP with virtually 100% activity. 2\. We developed the RTS to a simple and comprehensive tool for studying the accuracy of protein synthesis. Here, among others edeine (Ede) and pactamycin (Pct) were analyzed, EDE was found to be a strong inducer of misreading in contrast to Pct. The new drug NRI was found to be the first antibiotic showing a strong accuracy defect in the RTS system but a perfect accuracy on the standard poly(Phe) synthesis demonstrating the limitation of the latter. 3\. We developed a poly(U)-dependent poly(Phe) synthesis to a robust system yielding 100 to 300 Phe incorporation per ribosome with the following features: (i) 4.5 mM Mg2+ appears to be optimal concerning efficiency and accuracy in the polyamine system, (ii) high Phe incorporation allows the assessment of misincorporation [Leu/(Leu+Phe)] with a resolution limit of 1:10.000 (one misincorporation per 10.000 incorporated Phe) and determined the accuracy of poly(Phe) to be about 1:2000 (one Leu per 2000 Leu+Phe incorporations), (iii) misreading concerning the second nucleotide position is not observed and only very moderate misincorporation was found concerning the first nucleotide position, even when misreading was amplified by streptomycin or increased Mg2+ concentrations. 4\. Kasugamycin: The inhibitions mechanism was unraveled and together with crystallographic studies its binding site determined. We demonstrated that kasugamycin inhibits P-site tRNA binding through perturbation of the mRNA-tRNA codon-anticodon interaction near the E-site position during 30S canonical initiation. Our data explained why the 70S-type initiation on leaderless mRNA is not inhibited by this drug. 5\. Contradicting data on aminoglycoside effects on inhibition of the A site could be resolved. We showed that aminoglycoside can under artificial conditions induce a back-translocation of ribosomes confirming recent results from another group, but we could demonstrate that this effect plays no role for the inhibition mode of this important group of drugs and cannot be used to explain the bactericidal effect.
Parameter zweier in vitro Systeme zur Proteinsynthese wurden analysiert und verbessert, die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und Aufklärung ihrer Hemmechanismen angewendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1\. Optimierung eines gekoppelten Transkriptions- Translations-Systems (Rapid Translation System, Roche). Mit GFP als Reporter konnten große Mengen synthetisiert werden (bis zu 4 mg/ml), jedoch mit unbefriedigender Aktivität (ca. 50%). Ein Grund könnte die weit verbreitete T7 RNA Polymerase sein, deren Transkriptionsrate bis zu achtmal schneller ist als die der E. coli Transkriptase und damit die Kopplung von Transkription und Translation aufhebt. Tatsächlich wurde die aktive Fraktion erheblich angehoben, wenn entweder eine genetisch manipulierte, langsamere T7 Polymerase eingesetzt wurde oder die Inkubationstemperatur auf 20 °C erniedrigt wurde. Eine Abnahme der Proteinsynthese nach siebenstündiger Inkubation wurde nicht durch einen Mangel an Triphosphaten, sondern einen Mangel an Aminosäuren verursacht. Ein zweite Aminosäuregabe nach 7 Stunden bei 20°C führte zur Synthese von etwa 4 mg/ml bei praktisch voller GFP Aktivität. 2\. Das RTS wurde zu einem System für umfassende Analyse der Proteinsynthese-Genauigkeit modifiziert. Es wurden unter anderen Edein und Pactamycin analysiert. Das Edein, aber nicht Pactamycin entpuppte sich als starker Induktor von Fehleinbau. Einen überraschenden Befund gab es bei NRI: Es verursacht hohe Fehlereinbau, jedoch nicht im Standard poly(U) System (Leu gegenüber Phe Einbau), was eine Grenze des poly(U) Systems aufzeigt. 3\. Wir entwickelten unser Standard poly(U) System zu einem robusten Instrument und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phe Reste per Ribosom. Es hat folgende Merkmale: (i) 4.5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Synthese- und Fehleinbaurate. (ii) Hoher Phe-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10.000 (ein Fehleinbau per 10.000 eingebauten Phe). Das System weist einen Fehlereinbau von 1:2.000 auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Ein Fehleinbau bezüglich der wobble Position des Codons (dritte Nukleotidposition) häufig, einen bezüglich des mittleren Nucleotids des A-Codons wird nicht beobachtet, auch wenn der Fehleinbau dramatisch von Streptomycin oder angehobener Mg2+ Konzentration verstärkt wird; wohl aber ein sehr geringer Fehleinbau bezüglich der ersten Position. 4\. Kasugamycin: Der Hemmechanismus wurde aufgeklärt und zusammen mit kristallographischen Untersuchungen der Bindeort bestimmt: Das Antibiotikum hemmt die Bindung der P-tRNA nur in der 30S Untereinheit (jedoch nicht am 70S Ribosom), durch Störung der Codon-Anticodon Wechselwirkung nahe auf der Seite der E-Stelle. Unsere Daten erklären, warum die 70S Initiation von leaderless mRNA nicht von Kasugamycin gestört wird. 5\. Widersprechende Daten zu Aminoglycosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung wurden aufgelöst. Wir zeigten, dass unter artifiziellen Bedingungen Aminoglykoside eine Rück- Translokation auslösen (in Übereinstimmung mit jüngst publizierte Daten einer anderen Gruppe), aber auch dass dieser Effekt keinen Bedeutung für den Hemmechanismus hat und den bakteriziden Effekt dieser wichtigen Antibiotikagruppe erklären könnte.
