Staphylococcal enterotoxins (SEs) are heat-stable, highly potent superantigens produced by Staphylococcus aureus. They play a central role in staphylococcal food poisoning and toxic shock syndrome. SEs have the capacity to trigger disease even in the absence of viable bacteria due to their stability during food processing and storage, thus posing a substantial risk to food safety and public health. The classical five SEs, SEA to SEE, have historically been the primary focus of food safety monitoring. However, there has been an increasing association of additional SEs, such as SEG, SEH, and SEI, with outbreaks. The accurate detection of SEs at the protein level is essential, given that genetic detection does not verify the expression of the toxins. However, the use of immunoassays for the detection of SEs has been hindered by the interference of protein A (SpA), which is a well-known virulence factor produced by S. aureus. As SpA able to bind specific parts of antibodies, they can cause falsepositive signals in immunoassays which complicate result interpretation.
The first part of this work addressed the challenge of broadening the scope and detecting multiple SEs simultaneously, as existing commercial assays are limited to SEA–SEE and often suffer from insufficient sensitivity or specificity. A novel multiplex suspension immunoassay (SIA) was developed to enable the simultaneous detection, differentiation, and quantification of SEA through SEI from minimal sample volumes using Luminex® technology. To achieve this objective, high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against SED, SEH and SEI were generated through immunisation and hybridoma technology, followed by rigorous screening for high specificity and minimal cross-reactivity. Those mAbs together with mAbs against SEA, SEB, SEC, SEE, and SEG available at RKI were each implemented in both individual sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and a multiplex SIA format. The multiplex SIA achieved detection limits in the low picogram per millilitre range for all eight SEs, thereby enabling sensitive detection across the entire targeted toxin spectrum, SEA to SEI.
In the process of assay validation, a comprehensive panel of 145 whole-genome sequenced strains of Staphylococcus spp., and Enterococcus faecalis was analysed. The multiplex SIA accurately detected and distinguished the presence of SEA to SEI in the liquid culture supernatants of these strains, achieving assay accuracies between 86.9% and 100%, depending on the SE type. Importantly, the multiplex SIA was capable of detecting one to four sequence variants for each SE, reflecting the natural sequence diversity of SEs and ensuring broad epidemiological coverage. The performance of the multiplex SIA was further confirmed using three exemplarily selected complex food matrices: milk, a processed meat product, and cheese. The multiplex SIA demonstrated high recovery rates and reproducible results, thus confirming its suitability for practical food safety testing. The implementation of the mAbs in the multiplex SIA represents the first occasion on which simultaneous detection of SEA through SEI can be performed with such high sensitivity and specificity from a single, minimal-volume sample.
The second part of this work focused on the development and optimisation of a highly sensitive sandwich ELISA specifically targeting SEB, a clinically and historically significant SE. In view of the fact that SEB has been subject as a biothreat agent, precise and low-level detection of SEB is critical for both civilian and biodefence applications. A previously established sandwich ELISA for SEB with a detection limit in the low picogram per millilitre range was modified to overcome interference caused by SpA. To achieve this, detection antibodies were engineered by adapting the IgG subclass to reduce SpA binding and by generating antibody Fragments through recombinant expression, which lack the Fc domain targeted by SpA. Concurrently, control capture antibodies were meticulously selected to guarantee the differentiation of specific SEB binding and cross-reactivity to SpA. The resulting optimised ELISA successfully abolished false-positive signals due to SpA in S. aureus culture supernatants, while maintaining excellent sensitivity with a limit of detection in the one-digit pg/mL range. The findings demonstrate a practical approach to resolving SpA-related interference in SE detection assays without the need for pre-incubation with blocking sera, which frequently compromises assay sensitivity.
The methodology of optimising the antibodies for detection of SEs in bacterial supernatants was utilised in the development of the new multiplex SIA to the overcome major limitations of existing methods by directly addressing SpA interference.
In summary, the present work provides advanced, reliable tools for the sensitive, specific, and simultaneous detection of eight SEs. These developments will enhance diagnostic Methods for food safety monitoring, enable precise outbreak investigation, and support effective public health interventions in response to staphylococcal food poisoning events.
Staphylokokken Enterotoxine (SEs) sind hitzestabile, hochpathogene Superantigene, die von Staphylococcus aureus produziert werden. Sie spielen eine zentrale Rolle bei Staphylokokkenbedingten Lebensmittelvergiftungen und beim toxischen Schocksyndrom. Aufgrund ihrer hohen Stabilität während der Lebensmittelverarbeitung können SEs auch in Abwesenheit lebensfähiger Bakterien Symptome auslösen, womit ein erhebliches Risiko für die Lebensmittelsicherheit und die öffentliche Gesundheit einhergeht. Bisher standen besonders die klassischen fünf SEs, SEA bis SEE, im Fokus der Lebensmittelüberwachung. Inzwischen werden jedoch zunehmend weitere SEs wie SEG, SEH und SEI mit Ausbrüchen assoziiert. Molekulare Nachweismethoden, wie beispielsweise Gesamtgenomsequenzierung, sind nur eingeschränkt in Ausbruchsgeschehen nutzbar. Sie können nicht bestimmen, ob die mit dem Ausbruch in Verbindung gebrachten Bakterien auch tatsächlich Toxine exprimieren, weshalb eine genaue Detektion von SEs auf Proteinebene unerlässlich ist. Die Verwendung von Immunoassays zum Nachweis von SEs wurde bisher durch den verzerrenden Einfluss von Staphylokokken Protein A (SpA), einem von S. aureus produzierten Virulenzfaktor, erschwert. Die unspezifische Bindung von SpA an die konstante (Fc-) Region von Antikörpern führt zu falsch positiven Signalen, welche die Interpretation der Ergebnisse erschweren.
Der erste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Herausforderung, den Einsatzbereich auf SEA bis SEI zu erweitern sowie diese diversen SEs simultan zu erkennen, da bestehende kommerzielle Assays mit eingeschränkter Sensitivität und Spezifität auf den Nachweis von SEA–SEE beschränkt sind. Basierend auf der Luminex® Technologie wurde ein neuartiger Multiplex Suspensionsimmunoassay (SIA) etabliert, um die simultane Detektion, Differenzierung und Quantifizierung von SEA bis SEI aus minimalen Probenvolumina zu ermöglichen. Mittels Immunisierung und Hybridoma-Technologie wurden hochaffine monoklonale Antikörper (mAks) gegen SED, SEH, und SEI generiert, die anschließend auf hohe Spezifität und minimale Kreuzreaktivität analysiert wurden. Diese neuen mAks wurden gemeinsam mit bereits am Robert Koch-Institut verfügbaren mAks gegen SEA, SEB, SEC, SEE, und SEG sowohl in einzelnen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISAs) als auch im Multiplex SIA im Sandwich-Format implementiert. Der Multiplex SIA erreichte für alle acht SEs Nachweisgrenzen im niedrigen Pikogrammbereich pro Milliliter und ermöglicht damit die sensitive Detektion über das gesamte Spektrum der Zieltoxine SEA bis SEI.
'Im Rahmen der Assayvalidierung wurde eine 145 ganzgenomsequenzierte Stämme umfassende Kollektion von Staphylococcus spp. und Enterococcus faecalis analysiert. Der Multiplex SIA detektierte und differenzierte SEA bis SEI in den Flüssigkulturüberständen dieser Stämme, wobei je nach SE-Typ eine Genauigkeit zwischen 86,9% und 100% erreicht wurde. Bemerkenswerterweise war der Multiplex SIA in der Lage, ein bis vier Sequenzvarianten der SEs zu detektieren, womit die breite epidemiologische Abdeckung gewährleistet ist und die natürliche Sequenzvielfalt von SEs widergespiegelt wurde. Die Leistungsfähigkeit des Multiplex SIA in Lebensmittelproben wurde in drei beispielhaft aufgewählten komplexen Matrizen – Milch, einem verarbeiteten Fleischprodukt und Käse – weiter bestätigt. Der Multiplex SIA zeigte hohe Wiederfindungsraten und reproduzierbare Ergebnisse, was seine Praktikabilität in der Untersuchung von Lebensmitteln bestätigt. Die Implementierung der mAks in den Multiplex SIA ermöglicht erstmalig den simultanen Nachweis von SEA bis SEI mit hoher Sensitivität und Spezifität aus einer einzigen Probe mit minimalem Volumen.
Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung und Optimierung eines hochsensitiven Sandwich-ELISAs zur Detektion von SEB – ein klinisch und historisch bedeutendes SE. Angesichts der Tatsache, dass SEB als biologischer Kampfstoff gilt, ist ein präziser Nachweis von SEB in geringen Mengen sowohl für den Zivilbereich als auch für Anwendungen in der Bioabwehr von entscheidender Bedeutung. Um den negativen Einfluss von SpA auf die Ergebnisinterpretation zu reduzieren, wurde ein bereits etablierter Sandwich-ELISA für SEB mit einer Nachweisgrenze im niedrigen Pikogrammbereich pro Milliliter modifiziert. Hierfür wurde die Subklasse des Detektionsantikörpers so angepasst, dass die Bindung zu SpA minimiert wird. Des Weiteren wurde gezeigt, dass durch rekombinante Expression erzeugte Antikörperfragmente, die von SpA anvisierte Fc-Domäne fehlt und keine Bindung stattfindet. Simultan wurden sorgfältig Fängerantikörper als Kontrollen ausgewählt, um die Differenzierung zwischen spezifischer SEB-Bindung und Kreuzreaktivität mit SpA zu ermöglichen. Hieraus entstand ein optimierter Sandwich-ELISA, mit dem erfolgreich falschpositive Signale von SpA in S. aureus Kulturüberständen beseitigt wurden während gleichzeitig die ausgezeichnete Sensitivität von wenigen pg/mL als Nachweisgrenze beibehalten wurde. Dies zeigt einen praktischen Lösungsansatz von SpA-verursachten Verzerrungen in SE-Nachweissystemen auf, ohne dass eine Verminderung der Empfindlichkeit durch Vorinkubation mit blockierenden Seren erforderlich ist.
Bei der Entwicklung des neuen Multiplex SIA wurde die Methodik der Antikörperoptimierung für den Nachweis von SEs in bakteriellen Überständen berücksichtigt, um die SpA-Problematik bisheriger Nachweissysteme zu lösen.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit innovative, zuverlässige Werkzeuge für den sensitiven, spezifischen und simultanen Nachweis von acht SEs. Hiermit bietet sich das Potenzial, die Diagnostikmethoden für die Überwachung der Lebensmittelsicherheit zu verbessern, eine präzise Untersuchung von Ausbrüchen zu ermöglichen und wirksame Maßnahmen im Bereich der öffentlichen Gesundheit im Bereich von Staphylokokkenassoziierten Lebensmittelvergiftungen zu unterstützen
