Trotz intensiver Forschung an Radiochemotherapieschemata liegt die 5-Jahresüberlebensrate von Kindern mit Neuroblastom vom Hochrisikotyp noch immer bei nur 50%. Ein neuer, vielversprechender Ansatz ist die Kombination konventioneller Therapieprinzipien mit der spezifischen Inhibition zellulärer Signalwege, die für Tumorigenese verantwortlich sind. Imatinib ist ein Beispiel für dieses Konzept, das die 5-Jahresüberlebensrate von Patienten mit Chronisch Myeloischer Leukämie von 30% auf 89% verbesserte. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines synthetischen RNA-Interferenzscreens basierend auf einer Neuroblastomzelllinie mit hoher Doxorubicinresistenz und die Durchführung einer Pilotstudie zur Identifizierung potentieller therapeutischer Ziele für die Behandlung des Neuroblastoms. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf Durchflusszytometrie basierter Assay entwickelt, der mit SH-EP als Reporterzelllinie die Identifizierung von shRNA-mir- Expressionsvektoren erlaubt, die Neuroblastomzellproliferation verringern oder Doxorubicin induzierten Zelltod erhöhen. SH-EP Zellen wurden mit pGIPZ lentiviralen shRNA-mir Expressionsvektoren transduziert und anschließend drei Tage lang mit Puromycin selektioniert. Nach weiteren drei Tagen Wachstum +/- Doxorubicin wurden DNA-Gehalt und Zellviabilität mittels Durchflusszytometrie und dem Zellvitalitätstest MTT bestimmt. shRNA-mir-Expressionsvektoren gegen PLK1 und p53 wurden als Positivkontrollen etabliert, die Zellproliferation inhibieren und Zelltod verstärken, bzw. Doxorubicinresistenz erhöhen. Die Fähigkeit des Systems, therapeutische Ziele zu identifizieren, wurde mit 275 shRNA-mir-Expressionsvektoren gegen 69 Gene der Familie der F-box Proteine, Schlüsselregulatoren zellulärer Signalwege, exemplarisch nachgewiesen. Dieser Screen war in der Lage, drei Gene zu identifizieren, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Pathogenese des Neuroblastoms spielen: Fbxo5/Emi1, Fbxw11/β-TrCP2 und Fbxo45. Der Assay wies eine hohe Trennschärfe auf, da der Unterschied zwischen dem Signal der Positivkontrollen und dem Median regelmäßig mehr als 2σ betrug. Aufgrund dieser erfolgreichen Pilotstudie scheint es nun sinnvoll, weitere Genfamilien, deren Mitglieder bekanntermaßen Schlüsselpositionen in wachstumsregulierenden Signalwegen besetzen, mit dem entwickelten System zu untersuchen. Die Herausforderung besteht darin, den Durchsatz des Systems dadurch zu erhöhen, Durchflusszytometrie mit einem ähnlich sensitiven, aber weniger zeitaufwändigen Read-out zu ersetzen, wie zum Beispiel automatisierter Mikroskopie oder einem Fluoreszenz basierten Reportersystem. Damit wird es möglich sein, die Fragestellung des Screens auszuweiten und die Suche nach neuen therapeutischen Zielen für Patienten mit Neuroblastom vom Hochrisikotyp zu beschleunigen.
Even after extensive research on radiochemotherapy, the 5-year survival rate of children with high risk neuroblastoma still does not exceed 50%. A promising, new approach is the combination of conventional therapies with specific inhibition of cell signaling that promotes tumorigenesis. Imatinib set an impressive example for this concept by increasing the 5-year survival rate of chronic myeloic leukemia patients from 30% to 89%. In order to identify genes that could be inhibited to improve the therapeutic outcome of high risk neuroblastoma patients, we sought to establish an RNA-interference based synthetic lethal screen, using a highly doxorubicin resistant neuroblastoma cell line. We developed a flow cytometry-based assay, which enables the identification of shRNAmir expression vectors that reduce tumor cell proliferation or augment doxorubicin-induced cell death, employing SH-EP as neuroblastoma reporter cell line. SH-EP cells transduced with pGIPZ lentiviral shRNAmir expression vectors were selected with puromycin for three days. After subsequent growth in fresh medium +/-doxorubicin for three days, cell cycle distribution and cell viability were measured using flow cytometry and MTT assay. shRNAmir expression vectors targeting PLK1 and p53 were established as positive controls that markedly inhibit cell proliferation and increase cell death, or elevate doxorubicin resistance, respectively. The capacity of the system to identify potential therapeutic targets was assessed by knocking down the family of F-box proteins, key regulators of cellular signaling, using 275 shRNAmir expressions vectors targeting 69 genes. This screen recapitulated three genes known to play a role in neuroblastoma: Fbxo5/Emi1, Fbxw11/β-TrCP2 and Fbxo45. The employed positive controls, being more than two standard deviations from the mean, indicated the desirably high sensitivity of the assay. This successful pilot study now rationalizes a knock down strategy of larger groups of genes related to tumorigenesis, such as phosphatases and kinases. One major challenge will be to increase the throughput of the system by replacing flow cytometry with an equally sensitive but less time-consuming read-out, like automated microscopy or a fluorescence based reporter assay. This will allow broadening the scope of the screen and accelerate the quest for new drugable targets to increase the chance of successfully treating high risk neuroblastoma patients.
