Background: Long non-coding RNAs (lncRNA) play significant roles in regulating gene expression and maintaining cellular function through interactions with DNA, RNA and proteins. Among them, lncRNA CDKN2B-AS1 was identified as a genetic suscep-tibility locus associated with a variety of complex diseases, such as myocardial infarc-tion (MI), coronary artery disease (CAD), and severe periodontitis. However, despite a large number of studies revealing its role in cardiovascular disease, its molecular mechanism in oral diseases such as periodontitis has remained poorly understood. As severe periodontitis is a complex chronic inflammatory disease with high heritability, but its aetiology is still poorly understood, further research into the function of CDKN2B-AS1 in gingival fibroblast cells and its possible association with the risk of severe periodontitis is of great importance for uncovering the underlying molecular genetic mechanisms. Methods: We used LNA GapmeRs to reduce the transcript lev-els of CDKN2B-AS1 in primary gingival fibroblasts. The data were subjected to ge-nomwide expression-analysis (RNA-Sequencing), gene-set-enrichment analysis, and western blot validation. We computationally screened whether alleles of single-nucleotide-polymorphisms (SNPs), which were in strong linkage disequilibrium (r2 > 0.8) with CAD and periodontitis-associated lead SNPs and mapped to predicted regu-latory chromatin elements, changed the predicted binding affinities of transcription factors using the Transcription Factor Affinity Prediction software tool (TRAP). Antibody electrophoretic mobility shift analysis and Luciferase reporter assays in HeLa cells and gingival fibroblasts were used to functionally characterize these putative alleles. Results: Gene set enrichment analysis demonstrated that the most significantly up-regulated pathway was collagen biosynthesis with the adjusted P-value (Padj) of 9.7 x 10-5 and the area under the curve(AUC) > 0.65. Within this pathway, the risk gene of CAD and MI, COL4A1, exhibited the highest fold change (FC) in upregulation, with FC = 12.13, Padj = 4.9 x 10-25. The most substantially downregulated gene set was "TNFA signaling via NFKB" which was a inflammatory pathway with a Padj of 1 x 10-5 and AUC more than 0.60. At the single gene level, the gene Calpain Small Subunit 2 (CAPNS2) was the upregulated protein-coding gene with the lowest P value less than 9 x 10-24. Collagens and CAPNS2 are involved in the organization of the extracellular matrix. The risk variant rs10757278 was found to alter the binding site of the transcription fac-tor STAT1 with a p-value of 5.8 x 10-6. The rs10757278-G allele decreased STAT1 binding by 14.4%, while the rs10757278-A allele reduced luciferase activity by 41.2% (P = 0.0056) in gingival fibroblasts, consistent with the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project. Conclusion: The lncRNA CDKN2B-AS1 inhibits collagen gene expression in gingival fibroblasts. Dysregulation of CDKN2B-AS1 expression may exacerbate disease pro-gression by affecting collagen synthesis and tissue barrier integrity or by influencing the stability of atherosclerotic plaques.
Hintergrund: Die lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) spielt eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Genexpression und der Aufrechterhaltung der Zellfunktion durch In- teraktionen mit DNA, RNA und Proteinen. Unter ihnen wurde lncRNA CDKN2B-AS1 als genetische Suszeptibilitätslokus identifiziert, der mit einer Vielzahl komplexer Krankhei- ten wie Myokardinfarkt (MI), Koronarer Herzkrankheit (CAD) und schwerer Parodontitis assoziiert ist. Trotz zahlreicher Studien, die ihre Rolle bei kardiovaskulären Erkrankungen aufzeigen, bleibt ihr molekularer Mechanismus bei oralen Erkrankungen wie Parodontitis weitgehend unverstanden. Angesichts der Tatsache, dass Parodontitis eine chronisch entzündliche Erkrankung mit einem komplexen genetischen und umweltbedingten Hin- tergrund ist, ist eine weiterführende Erforschung der Funktion von CDKN2B-AS1 in Gingivafibroblasten und ihres potenziellen Zusammenhangs mit dem Risiko einer schwe- ren Parodontitis von großer Bedeutung, um ihren molekulargenetischen Mechanismus und die gemeinsamen pathologischen Prozesse verwandter Krankheiten aufzudecken. Methoden: Wir verwendeten LNA GapmeRs, um die Transkriptspiegel von CDKN2BAS1 in primären Gingivafibroblasten zu reduzieren. Anschließend wurde eine genom- weite Expressionsprofiliering mittels RNA-Sequenzierung durchgeführt. Die Daten wur- den anhand einer Expression- und Gen-Satz-Anreicherungsanalyse ausgewertet und durch Protein Blotting validiert. Wir haben Allele von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die in starkem Kopplungsungleichgewicht (r² > 0,8) mit CAD- und parodontaliti- sassoziierten Haupt-SNPs—computergestützt stehen und innerhalb von regulatorischen Chromatin-Elementen lagen, nach möglichen Veränderungen in vorhergesagten Tran- skriptionsfaktor-Bindungsaffinitäten untersucht. Dazu wurde die Software TRAP verwen- det. Antikörper-Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Analyse und Luciferase-Reporter-Assays in HeLa-Zellen und Gingivafibroblasten wurden verwendet, um diese potenziell funktionalen Allele zu charakterisieren. Ergebnisse: Die Gen-Satz-Anreicherungsanalyse zeigte, dass der am stärksten hochre- gulierte Signalweg die Kollagen-Biosynthese war, mit einem für multiples Testen korri- gierten P-Wert (Padj) von 9.7 x 10-5 und einem Bereich unter der Kurve (AUC) > 0.65. Innerhalb dieses Signalwegs zeigte das Risikogen für CAD und MI, COL4A1, die höchste Hochregulierung, mit einem Fold Change von 12.13 und einem Padj von 4.9 x 10-25. Im Gegensatz dazu trat der entzündliche Signalweg „TNFA-Signalisierung über NFKB“ als der am stärksten herunterregulierte Gen-Satz hervor, mit einem Padj von 1 x 10-5 und AUC = 0.60. Auf der Ebene einzelner Gene war das Gen Calpain Small Subunit 2 (CAPNS2) das am stärksten hochregulierte protein-kodierende Gen, mit einem log2- Fold-Change = 5.6 und P < 9 x 10-24. Kollagene und CAPNS2 sind an der Organisation der extrazellulären Matrix beteiligt. Es wurde gezeigt, dass die Risikovariante rs10757278 eine Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors STAT1 verändert (P-Wert = 5.8 x 10-6). Das rs10757278-G-Allel verringerte die STAT1-Bindung um 14,4 %, während das rs10757278-A-Allel die Luciferase-Aktivität in Gingivafibroblasten um 41,2 % reduzierte (P = 0,0056), ein Ergebnis, das mit den Daten des Genotype-Tissue Expression (GTEx) Projektes übereinstimmt. Fazit: Die lncRNA CDKN2B-AS1 hemmt die Expression von Kollagen-Genen in Gingivafibroblasten. Die Dysregulation der CDKN2B-AS1-Expression könnte die Krank- heitsprogression verschlimmern, indem sie die Kollagensynthese und die Integrität der Gewebebarriere beeinflusst oder die Stabilität atherosklerotischer Plaques beeinträchtigt.
