Messenger RNA (mRNA) undergoes a highly coordinated life cycle that starts with synthesis of the pre-mRNA in the nucleus and its maturation into mRNA and then ends in its decay, once the mRNA has completed its function. Once the mature mRNA is exported to the cytoplasm, the steps of mRNA processing referred to as “post-transcriptional gene regulation” determine the function and fate of the mRNA. Through a network of dynamic protein-protein/RNA interactions, these processes ensure the stability and quality of the transcripts and regulate mRNA storage for future usage. In this thesis, I have characterized protein-protein and protein-RNA interactions and their functional implications within two such networks in higher eukaryotes: nonsense-mediated decay (NMD) and AU-rich element (ARE)-mediated decay (AMD) involved in posttranscriptional gene regulation. I investigated the interaction between the SARS-CoV-2 Nucleocapsid (N) protein and the NMD factors, UPF1 and UPF2 to determine the interplay of the N-protein with NMD factors. I found that the N-protein interacts weakly with UPF1 and robustly with UPF2. Using biochemical and biophysical assays, I showed that N engages UPF2 in multi-partite interactions and prevents it from stimulating UPF1 catalytic activity. However, N can also inhibit the catalytic activity of UPF1 directly when present in excess. Nonetheless, inhibition of UPF1 activity does not translate to inhibition of cellular NMD by Nprotein. I speculate that the N-protein might specifically inhibit decay of viral genomic and subgenomic mRNA via the NMD pathway while leaving host-cell NMD targets unaffected. In context of regulation of ARE-mRNA, I have investigated interactions of the AU-binding protein Tristetraprolin (TTP) and the translational repressor GIGYF2. I have determined the structure of the GYF domain of GIGYF2 to a proline-rich sequence (PRS) of TTP. Using biophysical studies to complement structural observations, I defined the sequence features that determine specificity of a PRS for a GYF domain. My studies extend the canonical PRS for a GYF domain to a longer stretch rich in hydrophobic residues, providing a molecular basis for distinguishing among multiple PRS-motifs within TTP. Using mutants of TTP, I have investigated the role of TTP-GIGYF2 association on expression of an ARE-reporter mRNA in HEK293 cells. My findings showed that separating the effects of translational repression from degradation is a complex task as a great deal of redundancy is built into the physical and functional network that regulate expression of ARE-mRNA. Accordingly, I show a weak but direct interaction between the decapping factor DCP2 and GIGYF2 in vitro. I postulate that GIGYF2 might scaffold both TTP and DCP2, leading to formation of large mRNP where translation repression and decay are coupled. My observations highlight the need for further investigation of the composition of TTP-mRNP in cells. In summary, my studies highlight the dynamic, redundant and plastic nature of post-transcriptional gene regulation mechanisms.
Die Messenger-RNA (mRNA) durchläuft einen umfangreich koordinierten Lebenszyklus, der mit der Synthese der prä-mRNA im Zellkern und ihrer Reifung zur mRNA beginnt und mit ihrem Abbau endet, sobald die mRNA ihre Funktion erfüllt hat. Sobald die reife mRNA in das Zytoplasma exportiert wird, wird die Funktion und das Schicksal der mRNA durch verschiedene Verarbeitungsschritte bestimmt, die als “posttranskriptionelle Genregulation” bezeichnet werden. Durch ein Netzwerk dynamischer Protein-Protein/RNAInteraktionen stellen diese Prozesse die Stabilität und Qualität der Transkripte sicher und regulieren die mRNA-Speicherung für die spätere Verwendung. In dieser Arbeit habe ich Protein-Protein und Protein-RNA Interaktionen und ihre funktionellen Auswirkungen innerhalb zweier solcher Netzwerke in höheren Eukaryoten charakterisiert: Im Nonsense-vermittelter Zerfall (NMD) und im AU-reichem Element (ARE)-vermittelter Zerfall (AMD), die beide an der post-transkriptionellen Genregulation beteiligt sind. Ich habe die Interaktion zwischen dem SARS-CoV-2-Nukleokapsid (N)-Protein und den NMD-Faktoren UPF1 und UPF2 untersucht, um das Zusammenspiel des N-Proteins mit den NMD-Faktoren zu bestimmen. Ich fand heraus, dass das N-Protein nur schwach mit UPF1 aber stark mit UPF2 interagiert. Mithilfe biochemischer und biophysikalischer Assays konnte ich zeigen, dass N-und UPF2 durch multiple Interaktionenaneinander binden, wodurch das N-Protein UPF2 daran hindert, die katalytische Aktivität von UPF1 zu stimulieren. Allerdings kann N auch die katalytische Aktivität von UPF1 direkt hemmen, wenn es im Überschuss vorhanden ist. Die Hemmung der UPF1-Aktivität führt jedoch nicht zur Hemmung der zellulären NMD durch das N-Protein. Ich spekuliere, dass das N-Protein speziell den Zerfall viraler genomischer und subgenomischer mRNA über den NMD-Weg hemmen könnte, während es die NMD-Ziele in der Wirtszelle nicht beeinflusst. Im Bezug auf die Regulierung von ARE-mRNA habe ich die Wechselwirkungen zwischen dem AU-bindenden Protein Tristetraprolin (TTP) und dem Translationsrepressor GIGYF2 untersucht. Ich habe die Struktur der GYF-Domäne von GIGYF2 mit einer prolinreichen Sequenz (PRS) von TTP bestimmt. Mithilfe biophysikalischer Studien zur Ergänzung der Strukturbeobachtungen habe ich die Sequenzmerkmale definiert, die die Spezifität einer PRS für eine GYF-Domäne bestimmen. Meine Studien dehnen die kanonische PRS für eine GYFDomäne auf einen längeren Abschnitt aus, der reich an hydrophoben Resten ist und eine molekulare Grundlage für die Unterscheidung zwischen mehreren PRS-Motiven innerhalb von TTP bietet. Unter Verwendung von TTP-Mutanten habe ich die Rolle der TTP-GIGYF2- Assoziation bei der Expression einer ARE-Reporter-mRNA in HEK293-Zellen untersucht. Meine Ergebnisse zeigen, dass es ein komplexer Prozess ist, um Effekte der Translationsunterdrückung von denen des Abbaus zu trennen. Dies liegt darin begründet, VIII dass das physikalische und funktionelle Netzwerk, das die Expression der ARE-mRNA reguliert, sehr viel Redundanz aufweist. Dementsprechend habe ich eine schwache, aber direkte Interaktion zwischen dem Decapping-Faktor DCP2 und GIGYF2 in vitro nachgewiesen. Ich postuliere, dass GIGYF2 sowohl TTP als auch DCP2 als Gerüst dienen könnte, was zur Bildung eines großen mRNP führt, in dem Translationsunterdrückung und mRNA-Abbau gekoppelt sind. Meine Beobachtungen machen deutlich, dass die Zusammensetzung von TTP-mRNPs in Zellen weiter untersucht werden muss. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass meine Studien die dynamische, redundante und plastische Natur der post-transkriptionellen Genregulationsmechanismen unterstreichen.
