Dendritische Zellen (DCs), die zur Antigenaufnahme und -präsentation fähig sind, nehmen eine Schlüsselrolle in der Auslösung einer spezifischen zellulären Immunantwort ein. Daher stehen sie im Fokus vieler Forschungsansätze, die durch Modulation der spezifischen Immunantwort nach neuen therapeutischen Erfolgen suchen. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Subpopulationen von DCs beschrieben, die die phänotypische und funktionelle Heterogenität der DCs deutlich machen. Um die Rolle und Funktion von verschiedenen DC-Populationen im Immunsystem besser zu verstehen und immuntherapeutisch zielgerichteter einzusetzen, ist es notwendig, die verschiedenen DC-Populationen anhand von definierten und damit vergleichbaren Charakteristika zu analysieren. Ziel dieser Arbeit war es, durch unterschiedliche Ausreifungsstimuli verschiedene DCs in vitro zu generieren und sie anhand ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu vergleichen. Im Rahmen eines Gesamtprojektes sollte diese Dissertation alternative Verfahren aufzeigen, um kosteneffizient DCs mit verschiedenen Phänotypen und Funktionen zu entwickeln, um somit weitere klinische Anwendungen von DCs zu ermöglichen. Vorraussetzung für den Einsatz von DCs in der Immuntherapie ist, dass sie in ausreichend hoher Zellzahl isoliert werden können. Zu diesem Zweck wurden im ersten Schritt humane unreife DCs aus Monozytenkulturen mit unterschiedlichen konditionierten Medien ausgereift. Die konditionierten Medien wurden zuvor aus Kurzzeitkulturen von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Zusatz von bakteriellen Extrakten oder immunstimulatorischer DNA (CpG-Oligonukleotiden) gewonnen. Die vergleichende Analyse der unterschiedlich in vitro ausgereiften DCs umfasste die durchflusszytometrische Phänotypisierung, die Messung der Induktion von Antigen spezifischen und unspezfischen Lympozytenproliferationen in gemischten DC/Lymphozytenkulturen sowie die Fähigkeit zur Endozytose von Antigenen. Ergänzt wurde die Charakterisierung der DCs durch die Zytokinanalyse der konditionierten Medien und DC-Kulturen. In den aktuellen Verfahren werden DCs meist mithilfe eines Zytokin-Cocktails (CCs) ausgereift, die in unserer Arbeit als Referenz-DCs dienten. DCs, die wir mit konditionierten Medien von bakteriellen Extrakten oder CpG-Oligonukleotiden generierten, zeigten eine erhöhte Expression von kostimulierenden und Antigen präsentierenden Molekülen. Wir konnten zeigen, dass die konditionierten Medien DCs aktivieren und ausreifen können und sich darunter stabile DC-Phänotypen ausbildeten. Im Vergleich zu den o.g. CC-DCs zeigten die DCs, die mittels konditionierter Medien ausreiften, zudem höhere Anteile an Endozytose-Markern und stärkere Antigenaufnahmen durch Endozytose, während die CC-DCs ihre Fähigkeit zur Endozytose verloren hatten. Wir konnten weiterhin nachweisen, dass sich DC aktivierende, proinflammatorische und antitumorale Zytokine in den konditionierten Medien und DC-Kulturen befanden, darunter auch die entscheidenden Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6, welche im CC enthalten sind. Die Ergebnisse unserer Analysen veranschaulichen, dass sich je nach Stimulus unterschiedliche DC-Populationen in vitro generieren lassen, die sich durch verschiedene Phänotypen, Morphologien, Funktionen und Zytokinprofile auszeichnen. In weiteren Studien müssen die verschiedenen DC-Populationen auf ihre praktische Nutzbarkeit untersucht werden. Es ist vorstellbar, dass sich einzelne DC-Populationen für spezielle immuntherapeutische Anwendungen eignen. Wo bisherige Therapiestrategien noch unzureichend sind, eröffnet die Entwicklung der DCs aus konditionierten Medien zusätzliche klinische Behandlungsmöglichkeiten. Hierfür könnten je nach Verwendungszweck unterschiedliche DC-Populationen mit den charakteristischen Zytokinprofilen von Interesse sein. In der vorliegenden Arbeit wird ein reproduzierbares und kostengünstiges Verfahren zur in vitro Generierung von DCs mit therapeutisch erwünschten Eigenschaften vorgestellt und erweitert somit die denkbar klinische Einsetzbarkeit von DCs.
Dendritic cells (DCs) are widely recognized as the key antigen presenting cells that possess the ability to activate an specific immune reaction. DCs are receiving increasing scientific and clinical interest due to their key role in their modulation of immune response. There are a lot of different DC subtypes that have been detected in the last years and this reveals the phenotypic and functional heterogenity of DCs. It is important to realize the function of DCs and analyse their different characteristics of DC subtypes for adopting DCs in clinical use and to improve their therapeutic success. In our project we had the aim to maturate DCs in vitro with different stimuli and compare their phenotypic and functional qualities. We wanted to show alternative cost-effective methods for DC maturation with different phenotypic and functional characteristics to afford more clinical utilisation. One main condition for immunotherapy is to isolate DCs in large amounts. Therefore we isolated human immature DCs from monocytes and matured them with different conditioned media. Conditioned media were produced from short time cultures from peripheral monocyte blood cells with bacterial extracts or immunostimulatory DNA (CpG oligonucleotids). The comparison of these different in vitro generated DCs included phenotypic flow cytometries, measurement of antigen specific reactions, lymphocyte proliferations and endocytosis analyses. We also detected several cytokines in our conditioned media and in the different DC cultures. Actually the majority of DCs are matured with a specific cytokine cocktail (CC), that we used as reference DCs in our project. DCs generated with conditioned media from bacterial extracts or CpG oligonucleotids showed a high expression of costimulatory and antigen presenting molecules on their surface. We showed that our conditioned media can activate and mature DCs and that they developed robust phenotypes. They had a higher expression of endocytosis molecules on their surface and higher antigen absorption via endocytosis, while the CC-DCs lost their ability for endocytosis. Furthermore we demonstrated the different cytokine profiles containing a lot of proinflammatory and antitumoral cytokines in the condiotioned media and DC cultures, for example TNF-α, IL-1β and IL-6 that also exist in this specific cytokine cocktail. These results present different DCs with several phenotypes, morphologies, cytokine profiles and functions made from different stimuli. In future there should be more studies about their practical usability. It is imaginable that several DC populations qualify for special immuno therapies. The maturation of DCs from conditioned media seems to be a new possibility for clinical treatment. Maybe some of these DCs with their special cytokine profile are interesting for certain application. In this project we showed a reproducable method for in vitro DC maturation with requested characteristic that enhances the possible clinical applicability.
