In inflammatory bowel disease (IBD), the homeostasis between intestinal immunity, the epithelial layer and the microbiota is disturbed, resulting in an overreaction of the immune system, barrier damage and inflammation. The two major forms of IBD are Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The tight junction (TJ) regulates the passage of solutes between the spaces of adjacent cells. In UC patients the expression of tetra-span TJ-associated Marvel Proteins (TAMPs) including marvelD3 (MD3), occludin (Ocln) and tricellulin (Tric) are altered and thus TAMPs might play a role in the pathogenies of IBD. MD3 and Ocln are known to have more regulatory functions, whereas Tric and the tricellular TJ (tTJ) were found to be directly involved in paracellular macromolecule passage and presumably in immune cell migration. Hence, TAMPs might have immune regulatory functions.
To investigate this, mice with intestinal epithelial specific overexpression of either MD3, Ocln or Tric were subjected to dextran sulfate sodium (DSS) induced colitis, which initially targets the epithelium. Intestinal immune cells from the large intestine were isolated and analysed by flow cytometry to ascertain changes in immune cell subtypes due to TAMP overexpression (OE) under control and DSS conditions. Furthermore, RNA was isolated from colon tissue and expression of different pro- and anti-inflammatory cytokines was determined. Results showed that TAMP-OE caused alterations in the composition of subjacent immune cells. MD3-OE showed an increase in the occurrence of CD19+ B-cells, Tric-OE appeared to depress CD103+ subpopulations of both intraepithelial lymphocytes (IEL) and dendritic cells (DC), whereas Ocln-OE supported CD103+ IELs and DCs and additionally facilitated the maintenance of resident, particularly CD4+ resident macrophages in DSS-induced colitis.
As another project, organoid derived monolayers (ODM) were established and validated for their ability to mimic in vivo barrier properties. Organoids can fill the gap between traditional cell culture and animal experiments due to the greater complexity compared to cell lines and the better accessibility compared to animals. Moreover, organoids retain donor properties, which makes them a great tool for personalised medicine and many other research topics. Initial studies were performed comparing colon ODMs of healthy controls with those of UC patients. Comparison of duodenum ODMs to Caco-2 cells and duodenal tissue, demonstrated that ODMs reflected well both the para- and the transcellular properties of human duodenum tissue and therefore can be considered as a suitable and good model for barrier research. Initial analysis of colon ODMs from healthy controls and UC patients showed changes in transepithelial resistance (TER) and donor specific TJ-protein expression.
In conclusion, the results of the first part could further strengthen the hypothesis that TAMPs not only play a role within in the TJ but also influence neighbouring cells and compartments, as demonstrated here for immune cells. However, further studies need to clarify the outcomes of the changed immune cell composition in more detail and the regulatory mechanisms beyond. In the second project, the ODM model was successfully established in our laboratory and evaluated considering barrier properties indicating that this model reflects well the tissue properties and complexity. ODMs can therefore be used as a more realistic model than conventional epithelial cell lines to elucidate further mechanisms and drug targets for IBD.
In chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED; inflammatory bowel disease / IBD) ist die Homöostase zwischen dem intestinalen Immunsystem, dem Epithel und der Mikrobiota gestört, dies führt zu einer Überreaktion des Immunsystems, einer beschädigten Barriere und Entzündungen. IBD manifestiert sich in den zwei Hauptformen Morbus Crohn (MC; Crohn’s Disease / CD) und Colitis ulzerosa (CU; ulcerative colitis / UC). Der Durchtritt von Substanzen zwischen zwei benachbarten Zellen wird von der Tight Junction (TJ / Schlüsselleiste) reguliert. In UC-Patienten ist die Expression von TAMPs (TJ-associated Marvel Proteins) welche MarvelD3 (MD3), Occludin (Ocln) und Tricellulin (Tric) einschließen verändert. Es ist bekannt, dass MD3 und Ocln eher regulatorische Funktionen haben, während Tric und die trizelluläre TJ direkt am parazellulären Durchtritt von Makromolekülen und wahrscheinlich auch bei der Migration von Immunzellen beteiligt sind. Aufgrund der Expressionsveränderungen bei CED-Patienten und dieser Funktionen ergibt sich die Hypothese, dass TAMPs eine Rolle bei der Pathogenese von CED spielen und hierbei auch immunregulatorische Funktionen besitzen.
Um dies zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer intestinalen epithelialen spezifischen Überexpression von entweder MD3, Ocln oder Tric mit Dextransulfat-Natrium behandelt (dextran sulfate sodium / DSS) um eine chemisch-induzierte Kolitis hervorzurufen, welche zunächst das Epithel angreift. Um Veränderungen in Immunzellsubtypen durch die TAMP Überexpression unter Kontroll- und DSS-Bedingungen feststellen zu können, wurden Immunzellen des Dickdarms isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zusätzlich wurde die Expression von pro- und anti- entzündlichen Zytokinen bestimmt, indem mRNA von Dickdarmgewebe isoliert wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass eine TAMP-Überexpression zu Veränderungen in der Immunzellzusammensetzung führte. Bei einer MD3-Überexpression war das Vorkommen von CD19+ B-Zellen erhöht, eine Tric-Überexpression verringerte die CD103+-Unterpopulation von intraepithelialen Lymphozyten (IEL) als auch von dendritischen Zellen (DC), wohingegen eine Ocln-Überexpression zum vermehrten Vorkommen von CD103+ IELs und DCs führte. Zusätzlich unterstützte eine Ocln-Überexpression die Erhaltung von residenten Makrophagen, im speziellen von CD4+ residenten Makrophagen in DSS-induzierter Kolitis.
In einem weiteren Projekt wurden intestinale Organoide generiert, daraus erhaltene Einzelzellschichten (organoid derived Monolayers / ODM) in ihrer Verwendung als Modell der epithelialen Barriere etabliert und validiert. Organoide können die Lücke zwischen traditioneller Zellkultur und Tierexperimenten schließen, da sie komplexer als Zelllinien und gleichzeitig leichter verfügbar als Tiermodelle sind. Zusätzlich behalten Organoide spenderspezifische Eigenschaften, was sie zu einem guten Modell in personalisierter Medizin und vielen weiteren Forschungsthemen macht. Ein Vergleich zwischen duodenalen ODMs, Caco-2-Zellen und Duodenumgewebe zeigte, dass ODMs die para- und transzellulären Eigenschaften von humanem Duodenum gut darstellen konnten und daher als ein nützliches und gutes Modell für die Barriereforschung betrachtet werden können. Ein initialer Vergleich zwischen Dickdarm-ODMs von gesunden Kontrollspendern und UC-Patienten wiesen spenderspezifische transepitheliale Widerstände (transepithelial resistance / TER) und TJ-Protein Expressionen auf.
Zusammengefasst wurde im ersten Projekt die Hypothese gestärkt, dass TAMPs nicht nur eine Rolle innerhalb der TJ, sondern auch Einfluss auf benachbarte Zellen und weitere Kompartimente haben, wie hier gezeigt für Immunzellen. Nichtsdestotrotz müssen in weiteren Studien die Auswirkungen der veränderten Immunzellzusammensetzung und die regulatorischen Mechanismen dahinter im Detail untersucht werden. Im zweiten Projekt konnten ODMs erfolgreich in unserem Labor etabliert und in Bezug auf Barriereeigenschaften validiert werden. Die Barriereeigenschaften demonstrierten, dass ODMs die Gewebeeigenschaften und Komplexität gut widerspiegeln konnten. ODMs können daher als ein realistischeres Model als konventionelle epitheliale Zelllinien genutzt werden, um weitere Mechanismen und Angriffspunkte für Medikamente in CED zu identifizieren.
