Die Verwendung primärer humaner Leberzellen hat sich in den letzten Jahren zu einem Goldstandard entwickelt. Der momentane Bedarf an primären humanen Leberzellen wird größtenteils aus Leberteilresektaten gewonnen, die bei tumorchirurgischen Eingriffen reseziert werden. Eine weitere anerkannte Methode ist die Zellisolierung aus Organen, die aus unterschiedlichen Gründen nicht zur Transplantation zugelassen wurden.
Sorgen bezüglich einer Kontamination der gewonnenen Leberzellen mit Tumorzellen bzw. die Verfügbarkeit von abgelehnten Spenderorganen hat bisher eine breitere Verwendung dieser Zellquellen eingeschränkt. Ziel dieser Arbeit ist, die Nutzung erkrankter Organe von Transplantatempfängern zur Zellisolierung zu evaluieren.
Leberzellen aus 10 erkrankten (DG) und aus 12 abgelehnten Spenderorganen primär gesunder Spender (CG) wurden unter Anwendung eines standardisierten fünfstufigen Kollagenase-Perfusionsprotokolls isoliert. Zur Verkürzung der warmen Ischämiezeit wurde die Perfusionsmethode unter Verwendung von Foley-Kathetern optimiert.
Ergebnisse Das Ausgangsgewicht der erkrankten Organe war mit 1621 586g signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (1963 336g, p=0,048). Die durchschnittliche Ischämiezeit von 40 ± 14,1 min konnte durch Anwendung der Blasenkatheter-Methode signifikant auf 12 ± 5,2 min reduziert werden (p=0,0001). Die Vitalität der isolierten Leberzellen war bei DG (57 ± 16%) vergleichbar mit der Zellvitalität von CG (66 ± 13% (p= 0,26)). Zellaufreinigung führte zu einer Verringerung der Vitalität um 9% (DG) bzw. 12% (CG) und führte somit zu einem signifikanten Vitalitätsunterschied (p=0,04). Die Zellisolierung führte bei den Organen der Kontrollgruppe zu einer signifikanten Gewichtsreduktion vor- und nach Zellisolierung (p=0,001), bei erkrankten Organen führte die Zellisolierung zu keiner nennenswerten Gewichtsabnahme (p=0,564). Ein höheres Ausgangsgewicht der Organe führte nicht zu einer höheren Zellausbeute (CG: p=0,36; DG: p= 0,535) oder zu einer höheren Anzahl vitaler Zellen (CG: p= 0,536; DG: p=0,462). Bei erkrankten Organen war jedoch bei höheren Zellausbeuten tendenziell eine höhere Zellvitalität feststellbar (DG: p= 0,069 vs. CG: p=0,301) Interessanterweise zeigte sich in der Gruppe der erkrankten Organe eine Korrelation zwischen Volumen des Zellpellets (Volumen der Zellsuspension nach dreimaliger Zentrifugation und zweimaliger Resuspension) und der Zellvitalität (DG: p=0,007; CG: p=0,083).
Schlussfolgerung Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Isolierung von vitalen Zellen aus erkrankten Organen grundsätzlich möglich ist. Der Einfluss von Zellaufreinigung auf die Zellvitalität zeigt die Notwendigkeit die Zellaufreinigung zu optimieren, da höchstwahrscheinlich steatotische Zellen während der Wasch- und Resuspensionsintervalle mit dem Überstand abgegossen werden. Die in beiden Gruppen nicht nachweisbare Korrelation zwischen Ausgangsgewicht der Organe und den gemessenen Zellzahlen könnte auf einen unzureichenden Organverdau hinweisen und sollte ebenso in zukünftigen Studien untersucht werden, wie der Einfluss der Zellpelletgröße auf die Zellvitalität.
The demand for research purpose primary human liver cells is mostly covered by liver specimen obtained during liver tumor surgery or –with greater technical and logistical efforts- the use of livers rejected from the transplant program. To meet the growing demand, the isolation of liver cells from livers of transplant graft recipients was evaluated in this study. Liver cells were isolated according to a standardized five-step collagenase perfusion protocol as published before. 10 diseased livers obtained from liver transplant recipients (diseased grafts; DG) and 12 livers rejected from transplantation (control group CG) were included in this study. To minimize warm ischemic time a new cannulation method using standard foley catheters had to be established. Diseased grafts were significantly lighter (1679 ± 606g) as compared to healthy organs (1963 ± 336g; p=0.048). Due to the novel cannulation method using foley catheters ischemic time of diseased grafts was significantly reduced from 40 ± 14.1 min to 12 ± 5,2 min (p=0.0001). Mean ischemic time was 2.4 ±1.2h in DG and (10.9 ± 4.3h) in CG (p=0.00022) and did not show any impact on cell viability in either group (DG: p=0.437; GC: p=0.801). No correlation could be found between oxygen consumption and the total number of vital cells (DG: p=0.906 vs. CG: p=0.066) Post isolation cell vitality did not differ in either group. (DG57% ±16% vs. CG: 66 ±13%, p= 0.26). Cell purification led to a lower vitality in both groups and yielded a significant difference in cell vitality (DG: 48% ± 9% vs. CG: 56% ± 12%, p= 0.04). Cell isolation led to a significant reduction of organ weight in CG (p=0.001), whereas no significant pre/post isolation weight change could be observed in DG. A higher graft weight did not result in a higher cell yield (CG: p=0.36; DG: p= 0.535) or a higher number of vital cells (CG: p= 0.536; DG: p=0.462). Interestingly, a significant correlation between cell vitality and cell pellet volume (volume of cell suspension after centrifugation and re-suspension steps) could be observed in DG (DG: p=0.007; CG: p=0.083). Conclusion: This study demonstrates, that cell isolation from diseased whole human livers is possible. The impact of cell purification processes on cell vitality shows, that future projects have to focus on cell purification, since steatotic liver cells are most likely to be discarded during washing steps. The insignificant correlation between organ weight and cell counts might indicate insufficient organ digestion.
