Mit der Co-Precipitation-Crosslinking-Dissolution (CCD) Technik können in wenigen Schritten Protein-Mikropartikel hergestellt werden. Abhängig davon, welche Salzlösungen und Proteine für die Präzipitation verwendet werden, unterscheiden sich die resultierenden Partikel in ihren Eigenschaften und ihrer Morphologie. Es zeigte sich, dass durch die Präzipitation von Hämoglobin in MnCl2 mit Na2CO3 und anschließender Vernetzung sowie Auflösung der Salzschablone Hämoglobin-Mikropartikel, die HbMP, produziert werden konnten. Die HbMP haben eine erdnussartige Form, eine Partikelgröße von etwa 750 nm mit einer engen Größenverteilung und eine Proteineinschlussrate von 73 %. Die HbMP sollen als Hämoglobin-basierte Sauerstoffträger (HBOC) als Blutersatz im Menschen zum Einsatz kommen. In Bezug auf HBOC gibt es Sicherheitsbedenken hinsichtlich oxidativer Gewebsschädigung oder des Bindens von Stickstoffmonoxid und damit Auslösen einer Vasokonstriktion. In ersten prä-klinischen Untersuchungen wurden die HbMP daraufhin untersucht. Die HbMP weisen eine hohe Sauerstoffaffinität auf, dies verhindert sowohl eine Sauerstoffüberversorgung als auch eine Vasokonstriktion der kleinen Blutgefäße. Neben den prä-klinischen Untersuchungen zur Sicherheit der HbMP, spielt auch die Sicherheit bei der Herstellung der Partikel eine wichtige Rolle, da die HbMP nicht sterilisiert werden können. Bei klassischen Sterilisationsverfahren kommt es zu einer Denaturierung des Hämoglobins oder starken Bildung von Methämoglobin, wodurch die Partikel ihre Sauerstofftransportfähigkeit verlieren. Deswegen werden die Ausgangsmaterialien (insbesondere das Hämoglobin) und die produzierte Partikelsuspension intensiv auf ihre Keimbelastung untersucht. Es ist jedoch vorstellbar, dass einige Bakterien aufgrund ihrer geringen Konzentration bei den Standardtests nicht erkannt werden, deshalb wurde untersucht, wie sich diese Bakterien im Herstellungsprozess verhalten würden. Die biozide Wirkung von Glutaraldehyd und Ethylendiamintetraessigsäure, Chemikalien, die bei der Herstellung von HbMP verwendet werden, ist bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass beide Chemikalien das Bakterienwachstum in den bei der HbMP-Herstellung verwendeten Konzentrationen verhindern. Darüber hinaus wurde die Partikelproduktion mit Hämoglobinlösungen durchgeführt, die mit Escherichia coli oder Staphylococcus epidermidis versetzt waren. In den fertigen Partikelsuspensionen konnten keine lebenden Bakterien nachgewiesen werden. Aus allen Untersuchungen kann geschlossen werden, dass das Verfahren zur Herstellung von HbMP im Hinblick auf eine bakterielle Kontamination sicher ist und die produzierten Partikel die Anforderungen an einen universell einsetzbaren Blutersatzstoff erfüllen.
The co-precipitation-crosslinking-dissolution (CCD) technique can be used to produce protein microparticles in a few steps. Depending on the salt solutions and proteins that are used for the precipitation, the resulting particles differ in their properties and morphology. It was found that by precipitating hemoglobin in MnCl2 with Na2CO3, crosslinking and dissolution of the salt template hemoglobin microparticles (HbMP) could be produced. The HbMP have a peanut-like shape, a particle size of about 750 nm with a narrow size distribution and a protein entrapment rate of 73 %. The HbMP are intended to be used as hemoglobin-based oxygen carriers (HBOC) as a blood substitute in humans. With respect to HBOC, there are safety concerns regarding oxidative tissue damage or nitric oxide (NO) scavenging and thus triggering vasoconstriction. In initial pre-clinical studies, HbMP were evaluated for this. The HbMP exhibit a high oxygen affinity. This prevents both premature oxygenation and vasoconstriction of small blood vessels due to NO-scavenging. Due to the size of the HbMP of more than 100 nm but less than 1 µm, both penetration of the particles through the endothelial gaps and increased phagocytosis and disturbance of the microcirculation are prevented. In addition to pre-clinical studies on the safety of HbMP, safety also plays an important role in the production of the particles since they cannot be sterilized. In classical sterilization processes denaturation of hemoglobin or strong formation of methemoglobin occurs which causes the particles to lose their ability to transport oxygen. Therefore, the starting materials (especially hemoglobin) and the produced particle suspension are intensively tested for their bacterial load. However, some bacteria may not be detected by the standard tests due to their low concentration. Therefore, it was investigated how these bacteria would behave in the manufacturing process. The biocidal effects of glutaraldehyde and ethylenediaminetetraacetic acid, chemicals used in the manufacturing of HbMP, are well known. Both chemicals have been shown to inhibit bacterial growth at concentrations used in HbMP production. In addition, particle production was performed with hemoglobin solutions spiked with Escherichia coli or Staphylococcus epidermidis, respectively. No living bacteria were detected in the final particle suspensions. From all investigations it can be concluded that the manufacturing process of HbMP is safe regarding bacterial contamination and that the particles produced meet the requirements for a universally applicable blood substitute.
