New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) was first reported in 2009 from a patient who had traveled to India from Sweden and has been rapidly spread worldwide until today. Resistance by NDM-1 is commonly identified in strains of Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, and some other Gram-negative strains. Enterobacteriaceae are the largest family of clinically important bacteria, infections caused by them related to many diseases, e.g., gastroenteritis, hemorrhagic colitis, bacteremia, neonatal meningitis, urinary tract infections, intraabdominal infections, and pneumonia. With a broad substrate spectrum and improved stability for zinc ion starvation conditions compared with other B1 metallo-β-lactamases (MBLs), NDM-1 is currently one of the most challenging resistance factors threatening the efficacy of carbapenems, the last resort of β-lactam antibiotics. Synergistic usages of inhibitors for β-lactamases with β-lactam antibiotics have become a promising way for keeping the efficacy of carbapenems as well as other essential β-lactam antibiotics. However, until now no effective inhibitors for NDM-1-expressing pathogens are available for clinical treatment, thus there is an urgent requirement for the development of inhibitors targeting NDM-1. In this work, derivatives of DPA (dipicolinic acid or pyridine-2,6-dicarboxylic acid) and quinoline scaffold derivatives were developed as inhibitors for NDM-1 based on the initial fragment screening and supported by docking studies. The modified derivatives had improved inhibitory activity and binding affinity relative to the fragment hits, especially the substituted 8-sulfonamide derivatives such as compounds 94(YJh182), 95(YJh196) and 83(YJh174) with IC50 values ranging from 0.2 µM to 0.3 µM. The interaction modes of the top active and some other representative compounds with NDM-1 were studied by bio-layer interferometry (BLI), isothermal titration calorimetry (ITC), native protein mass spectrometry, thermal shift assay (TSA), circular dichroism (CD) and zinc restoration assays. The top active compounds 94(YJh182) and 95(YJh196) with the 4- or 5-phenyl groups were more specific for the active pocket of NDM-1 compared with compound 83(YJh174) according to docking studies and interacted with NDM-1 mainly by forming stable binding complexes of holo-NDM-1 with the inhibitors which was identified by native protein mass spectrometry. Compounds 94(YJh182), 95(YJh196) and 83(YJh174) all bound the protein reversibly under the BLI assay conditions, and the trend of the Kd values obtained from BLI assays correlated with the trend of the inhibitory activity of the inhibitors. The ITC assays showed binding of ligands to protein and binding of zinc ions to ligands. No or less significant changes for the secondary structures of NDM-1 treated with low excess of the inhibitors were detected by CD measurements, and some changes of the CD signals for NDM-1 treated with high excess of the inhibitors especially compounds 95(YJh196) and 83(YJh174) might be contributed by ligand binding. The inhibition by compounds 94(YJh182), 95(YJh196) and 83(YJh174) for NDM-1 can be partially restored by zinc ions, the different entropic changes observed in the ITC measurements could be contributed by conformational changes at the active site about the amino acid residues and the coordinated Zn(II) ions, and binding with the inhibitors reduced the thermal stability of NDM-1 which was identified via TSA studies. Furthermore, the activity of some representative compounds was also tested toward other clinically relevant B1 MBLs including IMP-1, VIM-2 and GIM-1, and all the tested compounds were potent inhibitors, which suggested that the developed inhibitors are broad-spectrum candidates for B1 MBLs. Activity tests by other metalloenzymes such as hCAII, HDAC-1 and MMP-2 showed that the tested inhibitors all had high selectivity for NDM 1 and had no inhibitory activity for hCAII and HDAC 1 at all. The selected substituted 8-sulfonamide inhibitors all could significantly reduce the MICs of meropenem for the bacteria recombinantly expressing blaNDM‑1 and clinical resistant isolates co-expressing blaNDM‑1 to susceptible levels with lower combined concentrations and had no or little effects on the proliferation and viability of HEK293 cells, which demonstrated that the substituted 8-sulfonamide inhibitors developed in this work are potent and non-toxic or weakly toxic Zn(II)-binding inhibitors targeting NDM 1 restoring the carbapenem susceptibility of multidrug-resistant clinical isolates. Above all, the best active inhibitors developed in this work for NDM 1 had improved specificity and inhibitory activity especially at the cell-level compared to most previously published Zn(II)-chelating or Zn(II)-binding inhibitors such as the AMA-type inhibitors, DPA derivatives and thiol-based structures. The interaction mode of forming protein-inhibitor complexes and reducing the thermal stability of NDM 1 is a more promising mode of action for drug-like candidates than other more toxic mechanisms such as the Zn(II) ion depriving function of EDTA or AMA-type inhibitors and the covalent binding mechanism which is generally limited to the cysteine or lysine residues at the active site.
Die Neu-Delhi-Metallo-β-Lactamase-1 (NDM-1) wurde erstmals 2009 von einem Patienten gemeldet, der von Schweden nach Indien gereist war, und hat sich bis heute schnell weltweit verbreitet. Antibiotika-Resistenz durch NDM-1 wird häufig in Stämmen von Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii und einigen anderen Gram-negativen Stämmen identifiziert. Enterobacteriaceae sind die größte Familie von klinisch wichtigen Bakterien, durch sie verursachte Infektionen sind mit vielen Krankheiten verbunden, z. B. Gastroenteritis, hämorrhagische Colitis, Bakteriämie, neonatale Meningitis, Harnwegsinfektionen, intraabdominale Infektionen und Lungenentzündung. Mit einem breiten Substratspektrum und verbesserter Stabilität bei Zinkionenmangel im Vergleich zu anderen B1-Metallo-β-Lactamasen (MBLs) ist NDM-1 derzeit einer der herausforderndsten Resistenzfaktoren, der die Wirksamkeit von Carbapenemen, den letzten β-Lactam-Reserve-Antibiotika. Synergistische Verwendungen von Inhibitoren für β-Lactamasen mit β-Lactam-Antibiotika sind zu einem vielversprechenden Weg geworden, um die Wirksamkeit von Carbapenemen sowie von anderen essentiellen β-Lactam-Antibiotika aufrechtzuerhalten. Bis jetzt sind jedoch keine wirksamen Inhibitoren für NDM-1-exprimierende Pathogene für die klinische Behandlung verfügbar, daher besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung von Inhibitoren, die auf NDM-1 abzielen. In dieser Arbeit wurden Derivate von DPA (Dipicolinsäure oder Pyridin-2,6-dicarbonsäure) und Chinolin-Gerüstderivate als Inhibitoren für NDM-1 entwickelt, basierend auf einem anfänglichen Fragment-Screening und unterstützt durch Docking-Studien. Die modifizierten Derivate hatten eine verbesserte inhibitorische Aktivität und Bindungsaffinität im Vergleich zu den Fragment-Hits, insbesondere die substituierten 8-Sulfonamid-Derivate wie die Verbindungen 94(YJh182), 95(YJh196) und 83(YJh174) mit IC50-Werten im Bereich von 0,2 µM bis 0,3 µM. Die Wechselwirkungsmodi des besten Wirkstoffs und einiger anderer repräsentativer Verbindungen mit NDM-1 wurden durch Biolayer-Interferometrie (BLI), isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), native Protein-Massenspektrometrie, Thermo-Shift-Assays (TSA), Zirkulardichroismus (CD) und Zink-Wiederherstellungsassays untersucht. Die besten Wirkstoffe 94(YJh182) und 95(YJh196) mit den 4- bzw. 5-Phenylgruppen waren laut Docking-Studien spezifischer für die aktive Tasche von NDM-1 im Vergleich zu Verbindung 83(YJh174) und interagierten mit NDM-1 hauptsächlich durch Bildung stabiler Bindungskomplexe von Holo-NDM-1 mit den Inhibitoren, die durch native Protein-Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die Verbindungen 94(YJh182), 95(YJh196) und 83(YJh174) bindeten alle unter den BLI-Testbedingungen reversibel an das Protein, und der Trend der aus BLI-Tests erhaltenen Kd-Werte korrelierte mit dem Trend der inhibitorischen Aktivitäten der Inhibitoren, obwohl die Werte durch die zusätzlichen Zinkionen im Testpuffer verschoben wurden. Die Ergebnisse der ITC-Assays spiegelten das Gleichgewicht für die Wechselwirkungen des gesamten Titrationssystems einschließlich des Proteins und der Liganden sowie der möglicherweise freigesetzten Zinkionen wider. Keine oder wenig signifikante Veränderungen der Sekundärstrukturen von NDM-1 wurden bei geringem Überschuss an Inhibitoren durch CD-Messungen nachgewiesen. Veränderungen der CD-Signale von NDM-1 könnten bei hohem Überschuss der Verbindungen 95(YJh196) und 83(YJh174) durch Ligandenbindung bewirkt sein. Die Hemmung von NDM-1 durch die Verbindungen 94(YJh182), 95(YJh196) und 83(YJh174) wurde teilweise durch zusätzliche Zinkionen aufgehoben. Es könnte zu Konformationsänderungen am aktiven Zentrum um die Aminosäurereste und die koordinierten Zn(II)-Ionen kommen, die in den ITC-Messungen beobachteten entropischen Änderungen beeinflussen könnten, und die Bindung der Inhibitoren verringerte die thermische Stabilität von NDM-1, wie durch TSA-Studien gezeigt wurde. Darüber hinaus wurde die Aktivität einiger repräsentativer Verbindungen auch gegenüber anderen klinisch relevanten B1-MBLs getestet, darunter IMP-1, VIM-2 und GIM-1, und alle getesteten Verbindungen waren starke Inhibitoren, was darauf hindeutet, dass die entwickelten Inhibitoren ein breites Wirkungsspektrum gegenüber B1 MBLs aufweisen. Aktivitätstests von anderen Metalloenzymen wie hCAII, HDAC-1 und MMP-2 zeigten, dass die getesteten Inhibitoren alle eine hohe Selektivität für NDM-1 und überhaupt keine inhibitorische Aktivität gegenüber hCAII und HDAC 1 aufwiesen. Alle ausgewählten substituierten 8-Sulfonamid-Inhibitoren reduzierten die MICs von Meropenem für Bakterien, die rekombinant blaNDM-1 exprimieren, und klinisch resistente Isolate, die blaNDM-1 koexprimieren, auf niedrige kombinierte Konzentrationen und hatten keine oder geringere Auswirkungen auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von HEK293-Zellen. Dies zeigte, dass die in dieser Arbeit entwickelten substituierten 8-Sulfonamid-Chinolinsäuren vielversprechende, potente und nicht bzw. schwach toxische Zn(II)-bindende Inhibitoren darstellen, die auf NDM-1 abzielen und die Carbapenem-Empfindlichkeit von Multidrug-resistenten klinischen Isolaten wiederherstellen. Vor allem zeigten die in dieser Arbeit für NDM-1 entwickelten Inhibitoren hatten eine verbesserte Spezifität und inhibitorische Aktivität, insbesondere auf Zellebene, als die bislang veröffentlichten Zn(II)-chelatbildenden oder Zn(II)-bindenden Inhibitoren wie dem AMA-Typ Inhibitoren, DPA-Derivate und Thiol-basierte Strukturen. Der Interaktionsmodus der Bildung von Protein-Inhibitor-Komplexen und der Verringerung der thermischen Stabilität von NDM-1 ist ein vielversprechenderer Wirkungsmodus für wirkstoffähnliche Kandidaten als andere toxischere Mechanismen wie die Zn(II)-Ionen-entziehende Funktion von EDTA oder AMA- Typ-Inhibitoren und der kovalente Bindungsmechanismus, der im Allgemeinen auf die Cystein- oder Lysinreste an der aktiven Tasche beschränkt ist.
