Introduction: Cell viability and survival are both dependent on cellular mechanisms maintaining Ca2+ homeostasis. Intracellular Ca2+ is substantially regulated by transient receptor potential channels (TRPs), which are overexpressed in various tumors. Ascorbic acid (Asc) administered in high doses (1 mM) is reported to reduce tumor cell survival, through promoting prooxidative responses. This study was undertaken to investigate whether high doses of Asc have cytotoxic effects through perturbing intracellular Ca2+ regulation by stimulating Ca2+ influx through augmenting TRPs activity in retinoblastoma (RB) cells. Methods: An etoposide-resistant and etoposide-sensitive RB cell lines (WERI-Rb1) were used and cultivated in RPMI-1640 Medium. For measuring the intracellular Ca2+ concentration and whole-cell currents, fluorescence Ca2+ imaging and the planar patch-clamp technique were used. Unspecific and specific TRP channel blockers were used as tools for characterizing TRPs involved in Asc-mediated Ca2+ influx. In addition, Trypan Blue staining was performed to determine the ability of RB cells to survive exposure to Asc. Results: Extracellular application of 1 mM Asc induced increases in the fluorescence ratio f340/f380, which is proportional to a rise in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i). Interestingly, this effect reached higher levels in the etoposide-resistant WERI-Rb1 cells compared to their etoposide-sensitive counterpart. The Asc-induced increases of f340/f380 could be clearly suppressed in the presence of different TRP channel blockers such as La3+ (500 μM), 2-APB (100 μM), Capsazepine (CPZ) (100 μM) and the broad-spectrum blocker N-Acetylcysteine (NAC) (10 mM). These results are in line with the corresponding rises in the whole-cell currents. Preincubation of the RB 7 cells with pertussis toxin (PTX) (50 ng/ml), an uncoupler of Gi/o binding proteins to their cognate GPCR coupled receptor, suppressed the Asc-induced Ca2+ influx. Microscopic analyses revealed that 1 mM Asc treatment reduced cell viability by almost 94 % in both WERI Rb1 cell lines. Conclusions: The effects of pharmacological doses of Asc on TRP channel-modulated Ca2+ homeostasis are described for the first time on RB cells. Therefore, it is assumed that 1 mM Asc acting as a prooxidant reduces etoposide-resistant and -sensitive WERI-Rb1 cell survival through altering intracellular Ca2+ regulation as a consequence of stimulation of a Gi/o-protein-mediated pathway linked to TRP channel activity. Based on the cytotoxic effects of Asc, on both etoposide-resistant and etoposide-sensitive RB cells, the development of TRP modulating drugs could be a possible approach to treat even cytostatic resistant tumor cells. Moreover, the results suggest that Asc should be evaluated as an adjuvant to improve therapeutic management of retinoblastoma cures.
Einleitung: Das Überleben von Zellen hängt von Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Calciumhomöostase ab. Intrazelluläres Ca2+ wird im Wesentlichen durch transient receptor potential channels (TRPs) reguliert, die in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Es wird berichtet, dass in hohen Dosen (1 mM) verabreichte Ascorbinsäure (Asc) das Überleben von Tumorzellen durch Förderung prooxidativer Reaktionen verringert. Diese Studie untersucht, ob hohe Asc-Dosen zytotoxische Wirkungen haben, indem sie die intrazelluläre Ca2+-Regulation durch Stimulierung des Ca2+-Einstroms und Erhöhung der Aktivität des TRPs in Retinoblastomzellen (RB) beeinflussen. 8 Methoden: Eine Etoposid-resistente und Etoposid-sensitive WERI-Rb1-Zelllinie wurde verwendet und in RPMI-1640-Medium kultiviert. Zur Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und der Ganzzellströme wurden Fluoreszenz-Ca2+-Imaging und die planare Patch-Clamp-Technik verwendet. Unspezifische und spezifische TRP-Blocker wurden zur Charakterisierung von TRPs verwendet, die am Asc-vermittelten Ca2+-Einstrom beteiligt sind. Zusätzlich wurde eine Trypanblau-Färbung durchgeführt, um die Überlebensfähigkeit von RB-Zellen gegenüber Asc zu bestimmen. Ergebnisse: Die extrazelluläre Zugabe von 1 mM Asc induzierte einen Anstieg des Fluoreszenzverhältnisses f340/f380, das proportional zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ist. Interessanterweise erreichte dieser Effekt in den Etoposid-resistenten WERI-Rb1-Zellen höhere Werte. Die Asc-induzierten Anstiege von f340/f380 konnten in Gegenwart verschiedener TRP-Blocker wie z.B. La3+ (500 μM), 2-APB (100 μM), Capsazepine (CPZ) (100 μM) und N-Acetylcystein (NAC) (10 mM) deutlich unterdrückt werden. Diese Ergebnisse stimmen mit den entsprechenden Anstiegen der Ganzzellenströme überein. Die Vorinkubation der RB-Zellen mit dem GPCR-Blocker Pertussis-Toxin (PTX) (50 ng/ml) unterdrückte den Asc-induzierten Ca2+-Einstrom. Mikroskopische Analysen zeigten, dass eine 1 mM Asc-Behandlung das Überleben der Zellen in beiden RB-Zelllinien um fast 94 % verringerte. Schlussfolgerungen: Die Auswirkungen pharmakologischer Dosen von Asc auf die TRP-modulierte Ca2+-Homöostase wurden erstmals in RB-Zellen beschrieben. Daher wird angenommen, dass 1 mM Asc als Prooxidationsmittel das Überleben von Etoposid-resistenten und -sensitiven WERI-Rb1-Zellen durch Veränderung der 9 intrazellulären Ca2+-Regulierung verringert. Dies geschieht als Folge der Stimulation eines Gi/o-Protein-vermittelten Weges, der mit der TRP-Aktivität verbunden ist. Basierend auf den zytotoxischen Effekten von Asc sowohl auf Etoposid-resistente als auch Etoposid-sensitive RB-Zellen, könnte die Entwicklung von TRP-modulierenden Medikamenten ein möglicher Ansatz sein, um auch Zytostatika-resistente Tumorzellen zu behandeln. Darüber hinaus könnte Asc als eine mögliche adjuvante Therapie evaluiert werden, um das Gesamtkonzept für die Behandlung von Retinoblastomen zu verbessern.
