Introduction: Lipoxygenases (ALOXs) form a class of nonheme-iron containing lipid peroxidizing enzymes. In contrast to bacterial ALOXs, the biological significance of which are still unknown, mammalian ALOX isoforms have been implicated in maturation, differentiation and inflammation. The reaction specificity of these enzymes is important for their biological roles. This dissertation explores the structural basis of the reaction specificity of different ALOX isoforms. It consists of three sub-projects that are thematically linked: 1. Search for new bacterial ALOX isoforms and their functional characterization. 2. Investigation of the reaction specificity of selected mammalian ALOX isoforms with various polyenoic fatty acids. 3. Studies on the ability of humALOX15 to form 18-HEPE from eicosapentaenoic acid. Methodology: For functional characterization selected ALOX isoforms were recombinantly expressed as N-terminal His-Tag fusion proteins in pro- and eukaryotic expression systems. Their functionality was characterized by in vitro activity assays and the pattern of their oxygenation products of various polyenoic fatty acids was analysed using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS /MS). Results: The publicly available databases were screened for potential bacterial ALOX sequences using a multi-step searching strategy. A previously unknown ALOX isoform was identified in the genome of Myxococcus fulvus. This enzyme was recombinantly expressed in E. coli and characterized with respect to its protein chemical and enzymatic properties. The M. fulvus lipoxygenase constitutes an arachidonic acid 12-lipoxygenating enzyme. Comparison of the oxygenation products synthesized from different polyenoic fatty acids by mammalian ALOX isoforms disclosed remarkable differences in the reaction specificity of individual ALOX isoforms and these results require reinterpretation of previous literature data. Human ALOX15 oxygenates eicosapentaenoic acid to 18-HEPE with low efficiency (1%) and preferential formation of the corresponding S-enantiomer was observed. It remains to be explored of whether this catalytic activity is relevant of in vivo resolvin formation. Conclusions: M. fulvus is one of the few bacterial species whose genomes contain functional ALOX genes. One of these genes encodes for an arachidonic acid 12-lipoxygenating ALOX isoform, the biological relevance of which will be explored in subsequent studies. The reaction specificity of mammalian ALOX isoforms with higher unsaturated fatty acids follows similar rules as the reaction specificity of arachidonic acid oxygenation. However, the specificity depends on the chemical structure of the substrate fatty acid and cannot directly be concluded from the specificity of arachidonic acid oxygenation. It must be determined experimentally for each enzyme-substrate combination.
Einleitung: Lipoxygenasen (ALOXn) bilden eine Klasse Nichthämeisen-haltiger lipidperoxidierender Enzyme. Im Gegensatz zu bakteriellen ALOXn, deren biologische Bedeutung noch weitgehend unklar ist, wurde die funktionelle Relevanz der Säugetierenzyme für die Zellreifungs- und Differenzierungsprozesse sowie für die Entzündungsreaktion eingehend untersucht. Die Reaktionsspezifität dieser Enzyme ist für die biologische Bedeutung der Lipoxygenasen relevant. Die vorliegende Dissertation setzt sich mit den strukturellen Grundlagen der Reaktionsspezifität verschiedener ALOX-Isoformen auseinander. Sie besteht aus drei Teilprojekten, die thematisch miteinander verknüpft sind: 1. Suche nach neuen bakteriellen ALOX-Isoformen und deren funktionelle Charakterisierung. 2. Untersuchung der Reaktionsspezifität ausgewählter Säugetier-ALOX-Isoformen mit verschiedenen Polyenfettsäuren. 3. Untersuchungen zu der Fähigkeit der humALOX15, 18-HEPE aus EPA zu bilden. Methodik: Die ausgewählten ALOX-Isoformen wurden als N-terminale His-Tag Fusionsproteine rekombinant in pro- und eukaryotischen Expressionssystemen exprimiert und wenn erforderlich mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die katalytische Funktion der so hergestellten Enzympräparate wurde anschließend in Aktivitätsassays quantifiziert. Das Muster der Oxygenierungsprodukte (Einfach- und Mehrfachoxygenierung) verschiedener Polyenfettsäuren konnte mithilfe der Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert werden. Ergebnisse: Mit einer mehrstufigen Suchstrategie wurden die öffentlichen Proteindatenbaken nach potenziellen bakteriellen Lipoxygenasesequenzen durchsucht. Dabei konnte im Genom des Myxococcus fulvus eine bisher nicht beschriebene ALOX-Isoform identifiziert werden. Dieses Enzym wurde anschließend in E. coli exprimiert und hinsichtlich seiner proteinchemischen und enzymatischen Eigenschaften charakterisiert. Dabei wurde die M. fulvus Lipoxygenase als Arachidonsäure 12-lipoxygenierendes Enzym identifiziert. Bei der Analyse der Reaktionsprodukte der humanen Lipoxygenasen mit unterschiedlichen mehrfach ungesättigten Fettsäuren ergaben sich bemerkenswerte Unterschiede in der Reaktionsspezifität dieser Enzyme mit verschiedenen Polyenfettsäuren, die eine Neuinterpretation bisheriger Literaturdaten erforderlich machen. Die humane ALOX15 kann Eicosapentaensäure in geringem Ausmaß (1 %) zu 18-HEPE umwandeln, wobei bevorzugt das S-Enantiomer gebildet wird. Ob diese katalytische Aktivität für die in vivo Bildung von Resolvinen bedeutsam ist, muss in separaten Tierexperimenten geprüft werden. Schlussfolgerung: Das Bakterium M. fulvus gehört zu den wenigen bakteriellen Spezies, deren Genome funktionelle ALOX-Gene enthalten. Eines dieser Gene kodiert für eine Arachidonsäure 12-lipoxygenierende ALOX-Isoform, deren biologische Funktion in weiterführenden Arbeiten näher charakterisiert werden soll. Die Reaktionsspezifität von Säugetier-ALOX-Isoformen mit höher ungesättigten Fettsäuren folgt ähnlichen Regeln wie die Reaktionsspezifität der Arachidonsäureoxygenierung. Sie kann jedoch nicht eins zu eins aus dem Muster der Arachidonsäureoxygenierungsprodukte abgeleitet werden, sondern muss für jede Enzym-Substrat-Kombination experimentell bestimmt werden.
